(Universitaire) - Immunohistochimie des ganglions lymphatiques

[invite1ee7d6fb]

Bonjour à tous,

J'ai un petit problème dans mon travail d'immunologie. Voici la prémisse:

"Vous achetez un anticorps monoclonal ayant la fiche de description suivante:
Antigène : CD4
Réactivité : Murine
Hôte: Rat
Type: monoclonal (YTS191-1) ; non-conjugué
Isotype: IgG2b, kappa.
Vous voulez identifier la localisation des populations CD4 dans des coupes de ganglions lymphatiques congelées. Vous observez beaucoup de bruit de fond lors de votre premier essai. On vous conseille d'utiliser un sérum non-immun de rat afin d'éliminer ce bruit de fond. Comment ce sérum résout-il le problème? Pensez aux ganglions ainsi qu'a la structure d'une Immunoglobuline."

Le sérum non-immun est un sérum de rat non-immunisé à l'antigène CD4. Il supprime donc les liaisons non-spécifiques de l'anticorps utilisé, ne laissant qu’après lavage des anticorps liés spécifiquement au CD4 en question. Je ne vois juste pas en quoi la structure du ganglion où celle de l'immunoglobuline vient faire la dedans... Ainsi, si l'anticorps est monoclonal, pourquoi il se lie à autre chose que le CD4, créant le bruit de fond?

Note sur le ganglion: CD4 est une population le lymphocytes T, qui se retrouvent dans le paracortex du ganglion lymphatique, grâce à des chimiokines influençant leur positionnement.

Structure de l'Ig: Deux chaînes lourdes identique et deux chaînes légère identique forment l'Ig. Chaque chaîne est composé d'une région variable, interagissant avec l'Ag, et une région constante, responsable de la transmission du signal.

Merci,
Julien
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[invite513ac0a6]

La manière de poser la question est un peu étrange, mais un fait à prendre en considération quand on fait de l'IHC (ou du FACS) sur des tissus lymphoides (ou contenant simplement beaucoup de cellules inflammatoires) est la fixation non spécifique des anticorps aux récepteurs Fc:

http://en.wikipedia.org/wiki/Fc_receptor

Les récepteurs aux IgG et en particulier FCgammaRII/RIII (CD16/32) sont fortement exprimés par un paquet de cellules immunitaires, d'où le bruit de fond quand on utilise une IgG pour reconnaitre notre cible d'intérêt. Le fait que L'AC soit monoclonal change pas grand chose vu que les récepteurs Fc reconnaissent la partie constante des AC. Donc le blocage va servir ici à saturer les sites de fixation non spécifiques de ton AC primaire, incluant ces recepteurs Fc.

[invite02e16773]

Salut,

Je n'ai pas tout compris.

Pourquoi un sérum de Rat ? Ca changerait quoi qu'il s'agisse de horse serum ou de bovine serum ?

Pourquoi préciser que le sérum doit être "non immunisé à l'antigène CD4" ? sous-entendu "non immunisé à l'antigène CD4 de souris ?"
Ca paraît évident que lorsqu'on achète du sérum, il ne s'agit pas du sérum d'un animal immunisé pour des antigènes d'autres espèces, non ?

[invite1ee7d6fb]

Moi aussi j'ai du mal à comprendre la logistique...

Voici un article de Nature qui dit que le blocage n'est pas vraiment nécessaire, car les récepteurs Fc ne maintiennent pas la capacité de lier les anticorps lorsque les cellules sont fixés. http://www.nature.com/srep/2011/1107...srep00028.html

Aussi, selon les petites recherches que j'ai fait, le sérum doit être de même provenance que l'anticorps qu'on utilise. Alors, vue que cet anticorps a été produit dans le rat, il faut du sérum de rat. Pourquoi? Pourquoi faut-il qu'il soit non-immun? Un sérum immun contiendra-t-il le même anticorps que celui qu'on utilise, amplifiant ainsi le marquage non-spécifique?

Des infos supplémentaires seraient appréciées.

Merci,
Julien

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite513ac0a6]

J'avais un peu lu de travers, du coup ca me semble étrange aussi, normalement le serum utilisé pour le blocage doit provenir de la même espèce que l'Ac secondaire, pas l'Ac primaire (sinon on va au contraire augmenter le bruit de fond, vu que l'Ac secondaire reconnaitra les Ac présents dans le serum de blocage, c'est un peu idiot...)

Pour les autres questions faut pas trop se laisser embrouiller par la sémantique, serum non immun=serum normal, serum immun=serum d'un animal qui a été immunisé avec notre antigène d'intérêt pour produire des Ac reconnaissant cet antigène.