PCR : bandes aspécifique et température

[betty68]

Bonjour à tous,

Mon post concerne une PCR sur un insert de grande taille (3kb).

J’ai commencé avec une température d’hybridation volontairement inférieur à celle du Tm de mes amorces car j’ai amplifié un autre insert dans le même programme de PCR.
Le résultat est le suivant :

61°C : présence de la bande correspondante à mon insert, pas de bandes aspécifiques

Cependant le clonage de mon insert n’ayant pas fonctionné comme attendu, j’ai recommencé plus tard une PCR afin de repartir de mon insert pour refaire le clonage.
Comme cette fois je n’avais qu’un seul produit à amplifier j’en ai profité pour augmenter ma température hybridation afin d’être plus proche des Tm de mes amorces.
Le résultat est le suivant :

64°C : présence de la bande correspondante à mon insert mais apparition d’une bande aspécifique à 750pb

Devant la présence de bandes aspécifiques, j’ai augmenté encore ma température d’hybridation afin d’obtenir un résultat plus spécifique.

70°C : présence de la bande correspondante à mon insert mais intensité plus faible, intensité élevée de la bande aspécifique

Finalement à ma surprise, avec une temperature plus élevée la bande correspondant à mon insert est d’intensité plus faible (normal, je diminue l’efficacité) mais ma bande aspécifique est quand à elle devenu très élevé, son intensité est bien plus élevé que celle de mon insert!

Je ne pense pas me tromper en disant que normalement plus la température augmente moins je devrais avoir d’insert amplifié mais aussi moins je devrais avoir de bandes aspécifiques?
Pensez-vous que cela vienne d’une contamination quelconque? La bande aspécifique me semble d’intensité vraiment élevé pour une contamination…
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[mantOs]

Pour ma part, je ne prete jamais attention au Tm de mes amorces et utilise 55° pour toutes mes PCR de clonage.
Quand ca foire, et que je suis sur de pas avoir fait de betise, je fais un gradient et vois ce que ca donne.
Et pour etre honnete, apres avoir fait enormement de clonage, ca a toujours marche comme ca.
Maintenant si tu sais qu'a 61° ca marche, reste a cette temperature.

PS : desole pas d accent sur clavier qwerty...

[betty68]

Merci pour ta réponse, je suis effectivement repartie de ma température de 61°C pour faire mon clonage.
J'étais un peu perturbé d'obtenir le résultat inverse que celui auquel je m'attendais (augmentation de la température d'hybridation entrainant l'apparition de bandes aspécifiques...) mais l'essentiel est d'avoir une condition qui fonctionne bien.