Bonjour tout le monde, je suis actuellement en 3eme année de licence mention Biologie des Organismes et Évolution. Dans mon cursus je dois préparé un certain nombre d'oraux dont un sur l'étude phylogénétique des salamandres à l'aide de séquences mitochondriales. J'ai donc un article à déficeler au mieux pour le présenter. Il se nomme "Mitochondrial sequence analysis of Salamandra taxa suggests old splits of major lineages and postglacial recolonizations of Central Europe from distinct source populations of Salamandra salamandra".
Mon problème réside dans la partie Matériel et Méthodes. Je ne comprend absolument pas leur méthode de séquençage et les outils utilisés. Voici cette partie d'article:
Est ce que vous connaissez un peu la méthode d'extraction au K/Phenol–Chloroform?DNA isolation and DNA sequencing
Genomic DNA was extracted from clipped toes or blood using the SDS-proteinase K/Phenol–Chloroform extraction method. The primer combination L-Pro-ML (5'-GGCACCCAAGGCCAAAATTCT 3') and H-12S1-ML (5'-CAAGGCCAGGACCAAACCTTTA 3') was used for amplifying the D-loop and sequencing. These primers were initially designed on the basis of sequences from Mertensiella luschani atifi. For sequencing the D-loop of E. platycephalus
we used the primer H-1478 of Kocher et al. (1989) and the specific primers E. platyc.-L (5'-GGCCCATGATCAACAGAACT 3') and E. platyc.-H (5'-GCTGGCACGAGATTTACCAA 3'). PCR was done in a 50-microL scale under standard conditions (Kocher et al. 1989). Amplified D-loop DNA was purified by using ultrafree-filters (Millipore, Bedford, MA, USA) and was afterwards used for symmetric cycle sequencing using either the Ready Reaction kit (Amersham, Freiburg, Germany) or the Big-Dye Ready-Reaction kit (Perkin Elmer, Weiterstadt, Germany). Sequencing products were analysed on an ABI™ 377 (Perkin Elmer) and the Sequence Navigator software (Perkin Elmer). We sequenced between one and three individuals from 49 Salamandra populations and this includes some populations that had formerly been given subspecific rank and that were subsequently synonimized (e.g. S. s. hispanica, S. s. werneri, S. s. bonnali ). Altogether we have sequenced the mitochondrial D-loop from 95 samples.
Je ne comprend pas ce qu'est un "primer combinaison L-Pro-ML et H-12S1-ML" est ce que vous en savez un peu sur ses amorces?
Les "ultrafree-filters" et les kits "Ready reaction" me sont complétement inconnus.
Je vous remercie de vos réponses. Désolé pour ce sujet un peu complexe lorsqu'on a pas lu tout l'article.
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