Besoin d'aide pour compréhension d'un article

[americaviper]

Bonjour tout le monde, je suis actuellement en 3eme année de licence mention Biologie des Organismes et Évolution. Dans mon cursus je dois préparé un certain nombre d'oraux dont un sur l'étude phylogénétique des salamandres à l'aide de séquences mitochondriales. J'ai donc un article à déficeler au mieux pour le présenter. Il se nomme "Mitochondrial sequence analysis of Salamandra taxa suggests old splits of major lineages and postglacial recolonizations of Central Europe from distinct source populations of Salamandra salamandra".

Mon problème réside dans la partie Matériel et Méthodes. Je ne comprend absolument pas leur méthode de séquençage et les outils utilisés. Voici cette partie d'article:

DNA isolation and DNA sequencing

Genomic DNA was extracted from clipped toes or blood using the SDS-proteinase K/Phenol–Chloroform extraction method. The primer combination L-Pro-ML (5'-GGCACCCAAGGCCAAAATTCT 3') and H-12S1-ML (5'-CAAGGCCAGGACCAAACCTTTA 3') was used for amplifying the D-loop and sequencing. These primers were initially designed on the basis of sequences from Mertensiella luschani atifi. For sequencing the D-loop of E. platycephalus
we used the primer H-1478 of Kocher et al. (1989) and the specific primers E. platyc.-L (5'-GGCCCATGATCAACAGAACT 3') and E. platyc.-H (5'-GCTGGCACGAGATTTACCAA 3'). PCR was done in a 50-microL scale under standard conditions (Kocher et al. 1989). Amplified D-loop DNA was purified by using ultrafree-filters (Millipore, Bedford, MA, USA) and was afterwards used for symmetric cycle sequencing using either the Ready Reaction kit (Amersham, Freiburg, Germany) or the Big-Dye Ready-Reaction kit (Perkin Elmer, Weiterstadt, Germany). Sequencing products were analysed on an ABI™ 377 (Perkin Elmer) and the Sequence Navigator software (Perkin Elmer). We sequenced between one and three individuals from 49 Salamandra populations and this includes some populations that had formerly been given subspecific rank and that were subsequently synonimized (e.g. S. s. hispanica, S. s. werneri, S. s. bonnali ). Altogether we have sequenced the mitochondrial D-loop from 95 samples.

Est ce que vous connaissez un peu la méthode d'extraction au K/Phenol–Chloroform?
Je ne comprend pas ce qu'est un "primer combinaison L-Pro-ML et H-12S1-ML" est ce que vous en savez un peu sur ses amorces?
Les "ultrafree-filters" et les kits "Ready reaction" me sont complétement inconnus.

Je vous remercie de vos réponses. Désolé pour ce sujet un peu complexe lorsqu'on a pas lu tout l'article.
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[renshin]

Bonjour,

Methode d'extraction au phenol-chlorophorme au SDS-protéinase K : On veut extraire l'ADN. On va mettre du phénol chloroforme dans notre echantillon pour précipiter les protéines. L'ADN reste en solution dans la phase aqueuse qui est récupérée par centrifugation. Ensuite on ajoute de l'ethanol pur qui précipite l'ADN puis récupérée par centrifugation. Ensuite ils ont rajouté une protéinase K pour détruire toute les protéines.

primer combinaison L-Pro-ML et H-12S1-ML : Ces amorces sont pour la PCR et servent à amplifier le D-loop de E. platycephalus. Je pense qu'il n'avait pas d'amorce pour la salamandre alors ils ont pris une paire d'amorce d'une cousine de la salamandre. Ils ont du faire pareille pour le séquençage en utilisant des amorces d'une espèce voisine.

"ultrafree-filters": Lors de ce stage j'ai pu utiliser ce genre de kit "Nucleospin". Ce sont des microtubes en deux partie avec une membrane de silice au milieu. On met notre amplicon dedans, puis on fixe l'adn sur la silice. On centrifuge pour éliminer tous qui ne se fixe pas sur la silice et on fait plusieurs lavage/centrifugation. Après ces lavages , l'ADN purifié est défixé avec un tampon.

[americaviper]

Super, tout y est ! Je te remercie ! J'aurais surement d'autres moins délicates questions sur l’article, mais ce n'est pas pour tout de suite.

Merci !

[renshin]

Pour les kits de séquençage, je connais pas trop. Si tu tapes sur internet, tu trouves les modes d'emploi où ils expliquent souvent le principe.

En tout cas bon courage

[A voir en vidéo sur Futura]