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cellules qui n'adhèrent pas...



  1. #1
    ahco

    Unhappy cellules qui n'adhèrent pas...


    ------

    Bonjour,
    Je travaille avec des cellules INS-1 (lignée de cellules bêta pancréatique issues d’insulinome de rat) qui sont normalement des cellules adhérentes. Mon problème c’est que celles que j’ai décongelées en début de semaine n’ont pas adhérées du tout…
    Je n’ai pourtant pas trouvé à première vue de signe de contamination (la collègue à qui j’ai les ai montré non plus). Le milieu n’était pas trouble et n’avait pas changé de couleur. Je n’ai pas testé les mycoplasmes (nous faisons peu de culture cellulaire et ne sommes pas équipés pour tester régulièrement).

    La composition du milieu que j’utilise est le suivant :

    Milieu RPMI-1640 (Gibco) 450 ml
    + SVF décomplémenté 5 % (origine : EU) 25 ml
    + L-glutamine (200 mM) 7.5 ml
    + Pénistreptomycine (50 U/ml ; 50 µg/ml) 5 ml
    + 1 mM Sodium pyruvate (100 mM) 5 ml
    + 50 µM bêta-mercaptoethanol à préparer extemporanément 500 µl
    (35 µl bêta-mercaptoethanol + PBS qsp 10 ml)
    + 10 mM HEPES (1 M) 5 ml
    + glc 30% 1.65ml

    Je me suis rendu compte après avoir décongelé que le pyruvate de sodium que j’avais utilisé était périmé depuis septembre 2013 (et ouvert depuis un bout de temps). Je me suis dit que dans la mesure où je filtre (sur filtre de 0,22µm) tout ce que j’ajoute au milieu de culture (sauf le SVF) ce n’était pas très important.
    Pensez-vous que mon problème puisse venir de là ?
    Merci

    -----

  2. #2
    camulus

    Re : cellules qui n'adhèrent pas...

    Bonsoir,

    Est ce que ce sont vos cellules ? Est ce vous qui les avez congelées ? Dans quoi ensemencez vous vos cellules ?
    Vos cellules sont elle vivantes ? Faites un bleu de trypan pour vous en assurer.

    Soit les cellules ont mal été congelées et n'ont pas supportée la congelation au quel cas vous ensemencez des cellules mortes ce qui expliquerait pourquoi elles n'adherent pas.

    Soit vos cellules ont mal été passées il est alors possible que votre lignée ait dérivée et qu'elle ait perdu sa capacité à adhérer et là c'est poubelle.

    Camu

  3. #3
    delphine69

    Re : cellules qui n'adhèrent pas...

    Salut,
    Sans vouloir te déprimer, des cellules qui n'adhèrent pas en 1 semaine sont toutes mortes... comment les as tu décongelées?

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