[exo] calculs PCR

[grandbeta]

Bonsoir !

J'ai des exercices en ce moment sur la PCR et j'ai du mal avec certaines questions.
Si quelqu'un pouvait m'éclairer (au moins sur la consigne) ce serait cool parce que je patauge beaucoup...

Alors, ça donne :
L'ADN génomique de l'Homme comporte 3 milliards de paires de bases.
L'expérimentateur a à sa disposition 10 ng d'ADN. Masse Molaire 1pb = 660g/mol.

Combien obtiendra-t-il de mole du fragment amplifié après 30 cycles ?
Combien cela représente t-il en quantité massique ?

La prof a rajouté que chaque phase de polymérisation dure 3 minutes et que chaque minute 1000pb sont produites.

Alors voilà quelques-unes de mes questions :
-Dans 10ng, il y a bien 3Md de pb ?
-Qu'est ce qu'on entend par quantité massique ?
-La dernière info veut bien dire que à chaque cycle, 3000pb sont produits ?

Ensuite, j'ai quand même essayé de faire des calculs mais je ne comprends pas comment arranger toutes les informations entre-elles...
Merci beaucoup pour votre aide !
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[Syst.]

Bizarre d'imaginer une PCR avec un génome humain entier mais bon…

Dans 10ng, il y a bien 3Md de pb ?

Non il n'y a pas 3 Gpb dans 10 ng d'ADN.
Pense à l'unité (/les dimensions) de tes valeurs, tu devrais trouver la relation qui te permet de trouver quelle quantité de paires de base il y a dans 10 ng de paires de base

Qu'est ce qu'on entend par quantité massique ?

quantité massique = quantité exprimée en masse

La dernière info veut bien dire que à chaque cycle, 3000pb sont produits ?

Bizarre la dernière info. 1000pb produit par minute par quoi ? Pas par la PCR, ce n'est pas possible.

Pour l'explication de la PCR :
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm
(Tu peux cliquer sur l'image en bas pour voir une animation qui montre l'augmentation du nombre de copies de chaque sorte.)

Je te conseille d'oublier la dernière info et considérer qu'il n'y a pas de limite ni même de ralentissement de l'augmentation de la quantité d'ADN produite pendant la PCR.

Ensuite c'est des maths d'un niveau qui t'es largement accessible.

[grandbeta]

Merci-merci-merci !
C'est plus clair mais je suis pas vraiment à l'aise avec les calculs et je me demande si j'aurais pas fait une boulette...
Voici les calculs que j'ai fait, si vous avez le temps et que ça vous embête pas d'y jeter un œil.

-Quantité de pb dans 10ng d’ADN :
Dans une mole de pb, il y a 660g de pb donc (N=n*Na) 6.02*10^23 de pb.
Donc dans 10ng = 10^-8g, il y en a (Na*10^-8)/660 = 9.12*10^(-12).

-Nombre de pb à la fin des 30 cycles :
Comme ça je dirais, à chaque cycle, il y a +3000pb donc au final nb-de-pb=9.12*10^(-12)+30*3000.
Mais j’ai que théoriquement ça augmentait de façon exponentielle donc la fin ça devrait faire 3000*2^30 de plus pb ? Enfin, là je vois pas trop.

-Et sinon après pour avoir le nombre de pb final en nombre de moles, on refait un produit en croix :
1mol = 6.02*10^23pb
X mol =nb-final-de-pb
X = nb-final/Na moles
Est-ce que c’est correct ?

[Syst.]

J'ai compris l'histoire du génome humain…
Ce qui est amplifié n'est pas le génome entier (évedemment…) mais un fragment du génome, une séquence précise qui n'existe qu'en un seul exemplaire dans le génome. (L'énoncé devrait le suggérer quelque part.)

(N=n*Na)

L'énoncé demande un résultat en moles donc reste en moles, n'utilise pas le nombre d'Avogadro.

= 9.12*10^(-12)

Obtenir un résultat en 10^-12 après avoir fait globalement 10^24*10^-8/10^3 devrait te faire réagir :
24 − 8 − 3 = 13
Tu as un − en trop devant ton 12
(De toute façon tu devrais refaire le calcul sans Na.)

-Nombre de pb à la fin des 30 cycles :

La PCR amplifie des fragments d'ADN, et l'énoncé demande le nombre de moles de fragment obtenu, donc d'abord tu devrais déterminer combien tu as de fragments dans ton échantillon, c'est-à-dire combien de génome humain tu as dans ton échantillon.
Tu as précédemment calculé la quantité de paires de base que tu as dans ton échantillon et tu sais combien il y a de paires de base dans un génome humain (haploïde) donc tu peux calculer.

Une fois que tu as la quantité de génome/fragment en mole dans ton échantillon tu pourras calculer combien de fragments d'intérêt tu as au bout de 30 cycles.
Si tu ne vois pas comment, regarde à nouveau le lien que je t'ai passé.

As-tu réécrit tout l'énoncé d'origine ou seulement des morceaux ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[grandbeta]

Bonjour,
J’ai refait le calcul en restant en moles ce qui fait 1.51*10^(-11) (vraiment – ce coup-ci ^^) moles d’adn génomique dans les 10ng de départ.
Pour trouver combien de fragments dans ton échantillon, c'est-à-dire combien de génome humain dans ton échantillon.
J'ai fait ces calculs mais je ne vois pas comment faire sans avoir la longueur du fragment qu'on veut répliquer (à moins que les 10ng ne contiennent que ce qu'il y a à amplifier...)

quantité de paires de base échantillon: 9,12*10^12pb = 1,51*10^-11 moles
paires de base dans un génome humain : 3*10^9pb = 4,97*10^-15 moles
9,12*10^12 / 3*10^9 = 3040, donc ça voudrait dire qu'il y a 3040 fois le génome humain dans les 10ng d'adn de départ.
Donc que le fragment d’intérêt est au départ 3040 fois présent... donc si les 10ng ne sont «que du fragment»,
un fragment = un génome = 1,51*10^-11 / 3040 = 4,97*10^-15 moles

Pour le «Facteur d’augmentation»:
Copies cibles: 1073741764 = (2^n – 2n) = 2(2^(n-1) – n)
Copies longues:60 = 2n
Total:1073741824 = 2^n

(Est ce qu’on compte les fragments qui appartiennent à des brins d’adn plus longs que seulement le fragment ou pas ? Là j'ai pris 2^n comme je suis partie en disant de les 10ng n'étaient constitués que de fragment ce qui m'a l'air bizarre quand même...)

Sinon, je ferais (nombre de moles de fragment au début)*(2^30) = (1,51*10^-11)*(2^30) = 0,162 moles du fragment de début amplifié en comptant les fragments des « brins d’origines ».

Merci

(Au début il y avait juste :
On cherche à amplifier par pcr à partir d’adn génomique un fragment qui contient un gène d’interêt. Pour ça, on met en présence 2 amorces, des désoxynucléotides et la polymérase.
Les séquences des amorces et que j’ai recopié dans #1.)

[Syst.]

Bonjour,

3*10^9pb = 4,97*10^-15 moles

Tu devrais écrire pb/génome et [moles de pb]/génome pour te mettre les idées au clair.
Pourquoi convertir le nombre de paires de base du génome humain en nombre de moles de paires de base par génome ?
Tu veux obtenir le nombre de moles de génome que tu as dans ton échantillon (unité : génome/Na/échantillon), tu as le nombre de moles de paires de base dans ton échantillon (pb/Na/échantillon) et le nombre de paires de base par génome (pb/génome). Sans utiliser le nombre d'Avogadro tu peux arriver au nombre de moles de génome dans ton échantillon.

il y a 3040 fois le génome humain dans les 10ng d'adn de départ

C'est ça, mais il faut le résultat en moles.

1,51*10^-11 / 3040

Tu viens de faire le calcul (pb/Na/échantillon)/(génome/échantillon) donc tu obtiens un résultat en pb/Na/génome c'est-à-dire le nombre de moles de pb par génome, valeur que tu avais déjà… (et qui n'est inutile)
Si tu ne vois pas la signification de tes calculs, pense aux unités ou aux dimensions de tes valeurs. (Ça évite de faire des bêtises…)
Le résultat que tu veux obtenir est en fragment/Na/échantillon
Il y a un fragment par génome (c'est sous-entendu quand ce n'est pas précisé) donc il n'y a qu'à multiplier par 1 (fragment/génome) ton génome/Na/échantillon pour le convertir en fragment/Na/échantillon. (c'est-à-dire aucun calcul à faire)

Une fois que tu as le nombre de fragments dans ton échantillon avant la PCR, il te faut le nombre de fragments après 30 cycles de polymérisation.
Normalement c'est le nombre de fragment seul (copie cible) qui t'intéresse.

Une animation qui t'éclaircira peut-être les idées sur la PCR :
http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ (Je ne trouve plus la version française. Dis-moi s'il y a quelque chose que tu ne comprends pas.)

Y a-t-il un moyen de connaitre la longueur de la séquence amplifiée avec ton énoncé ?

[grandbeta]

Bonjour,
J’ai recommencé en essayant de redécomposer :
Nombre de moles de fragment après 30 cycles
= Facteur d’augmentation * Nombre de moles de fragment après 1 cycle
= Facteur d’augmentation * (Nombre de moles de fragment sur un génome * nbre de génome dans 10ng)
= 1073741764 * (Nombre de moles de fragment sur un génome * 3040)

La longueur du fragment, je suppose qu’il faut se servir du « débit » de 1000 pb/min de la polymérase et du fait que le 1er cycle dure 3 minutes donc le fragment ferait autour de 3000pb ( ?).
Donc :
3000pb = 4.98*10^-21 moles (produit en croix avec 1 mole de pb = 6.02*10^23 pb).

Au final :
Nombre de moles de fragment après 30 cycles
= 1073741764 * (4.98*10^-21 * 3040)
=1.63*10^-8 moles.
(Avec les calculs précédents pour 3040 et le nombre de copies cibles au bout des 30 cycles).
Voilà, j’espère que c’est correct, je sais que je n’ai pas suivi exactement ce que vous me disiez de refaire mais j’avais un peu de mal à voir. En tout cas merci beaucoup pour votre aide et ouais… j’espère que c’est pas trop mauvais.
Bonne journée.

[Syst.]

Bonjour,

Désolé je n'ai pas vu ton message avant…

C'est sûrement trop tard mais bon…

Ce n'est toujours pas le bon calcul.

Avant chaque calcul il faut savoir ce que tu veux obtenir.

= 1073741764 * (Nombre de moles de fragment sur un génome * 3040)

La longueur du fragment, je suppose qu’il faut se servir du « débit » de 1000 pb/min de la polymérase et du fait que le 1er cycle dure 3 minutes donc le fragment ferait autour de 3000pb ( ?).
Donc :
3000pb = 4.98*10^-21 moles (produit en croix avec 1 mole de pb = 6.02*10^23 pb).

Au final :
Nombre de moles de fragment après 30 cycles
= 1073741764 * (4.98*10^-21 * 3040)

Là il y a un problème

D'abord pourquoi avoir converti la longueur supposée du fragment en nombre de moles de paires de base ?

La valeur numérique qui te "manquait" dans le premier calcul était le nombre de mole de fragment par génome.
Je t'ai dit qu'il y a un fragment par génome, donc il y a 1/Na moles de fragment par génome.

Le 1,63*10^-8 que tu as obtenu correspond au nombre de moles de paires de base intégré dans tes fragments si tes fragments font 3000pb (ils font moins à mon avis). Ce n'est pas la valeur que tu cherches.

Tu devrais laisser tomber l'histoire de la longueur du fragment s'il n'y a pas plus de précision dans l'énoncé à ce sujet.

C'est le nombre de moles de fragments qu'il faut obtenir.

Dans un exercice comme ça il vaut mieux faire tous les calculs sans valeur numérique du début à la fin puis utiliser les valeurs au dernier moment.
On s'embrouille moins de cette façon.

Bonne journée à toi.