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Déterminer état de dimérisation d'une protéine



  1. #1
    quent155

    Déterminer état de dimérisation d'une protéine


    ------

    Bonjour à tous !

    Voilà lors d'un travail de recherche, je souhaitais faire cristalliser une protéine. Pour se faire j'ai exprimé et purifié celle-ci. La dernière purification est une size exclusion afin d'avoir un échantillon "mono-dispersé". Sur le graphe de ma SEC, je peux voir un premier pic qui sort rapidement, un second un peu plus tard et autre directement après.

    Je me demandais donc comment expérimentalement on pouvait déterminer quel "polymère" était associé à chaque pic (il s'agit bien de la protéine, vérifié par SDS-PAGE).
    Dans les techniques courants d'analyse biochimique (je termine un master en chimie, donc mes connaissances dans ce domaine sont limitées) je ne vois pas ce qui pourrait donner cette info... Une SDS dénaturant la protéine ne peut donner cette info. Une masse spectre donne des ions moléculaires, mais dans le cas de protéine les liaisons inter-protéine sont conservées ? J'ai des doutes...
    La seule chose qui me vient en tête c'est un titrage calorimétrique isotherme, mais en général c'est plus pour observer la liaison de substrat dans un site de liaison du coup j'ai des doutes...

    Si vous avez des idées (même si l'équipement n'est pas toujours commun) n'hésitez pas ! Je ne ferai probablement pas la manip' mais c'est une question que je me pose...


    Merci pour vos réponses !

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  3. #2
    berzelius

    Re : Déterminer état de dimérisation d'une protéine

    Bonsoir,

    ca date un peu, donc j'ai oublié les détails.

    En gros tu as tes deux protéines liées par liaisons faibles, le plus simple c'est de les lier de manière covalente par XXX (j'ai oublié...) et après tu digère par enzymes et tu analyses par spectro de masse les fragments (MS puis MS/MS pour avoir la séquence) puis à la main ou par bio info tu aligne les sequences et tu peux retrouver quelle partie va ou, c'est pas hyper précis mais au moins tu connait les protagonistes et tu a une idée générale des zones d'interraction ou de non interraction.
    C'est une technique utilisée aussi pour l'étude des ponts disulfures.
    "le campbell est ton ami, mais un mauvais oreiller..."

  4. #3
    TanguyE

    Re : Déterminer état de dimérisation d'une protéine

    Bonjour,

    Normalement le premier pic de ton chromatogramme, c'est tout ce que tu n'as pas purifié avant de faire la size-exclusion. Les deux pics suivants, ça dépend un peu de ton échantillon.

    Le seul moyen de savoir qui est qui, ce serait un gel en conditions non dénaturantes pour conserver les dimères.

    ps: bon courage pour la crystallo

  5. #4
    quent155

    Re : Déterminer état de dimérisation d'une protéine

    Bonjour !

    La question date un peu mais avoir la réponse m'interesse toujours !
    J'ai fini de bosser sur ce projet mais j'en commence un nouveau sur une protéine qui forme des dimères de dimères donc ça reste interessant !

    Berzelius > La seule façon que je vois pour créer des liens covalents c'est des mutants de surface type cystéine pour justement former des ponts disulfures. A part ça je ne vois pas trop. Mais au final, même si on a une idée des interactions ça ne permet pas de déterminer l'état d'oligomérisation de la protéine, si ?


    TanguyE > Merci ! La cristallo s'est bien passé, la structure de l'apoprotéine a été résolue
    Sinon tu parles d'un gel en conditions non dénaturantes, perso je n'ai jamais fait que de la SDS-Page... Tu connais une technique sur gel qui permet de garder la protéine intacte ? (Là tu m'interesses beaucoup )

  6. #5
    quent155

    Re : Déterminer état de dimérisation d'une protéine

    Bon et bien je viens d'avoir la réponse et c'est beaucoup plus simple que ce qui a été dit avant...

    Il suffit de faire une droite de calibration avec des protéines (monomériques) dont le MW est connu. On met le MW en fonction du temps d'élution et on regarde à quel MW correspond le temps d'élution de notre protéine. On peut alors savoir de quel oligomère il s'agit !

    C'était tout simple en fait

  7. A voir en vidéo sur Futura

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