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determiner la localisation subcellulaire d'une proteine végétale



  1. #1
    katiaestelle

    Exclamation determiner la localisation subcellulaire d'une proteine végétale


    ------

    J'ai transformé des protoplastes d'Arabidopsis (PLANTES!!) avec des fusion-GFP avec comme témoin la GFP seule. C'est bien gentil mais comment vraiment savoir où est localisé la protéine car les photos sont pas très clairs.
    1) Je pense qu'on peut co-transformer avec d'autres proteines dont on connais la localisation subcellulaire, en la fusionnant avec un autre fluorochrome?
    2) Qu'est ce qui est utilisé en routine comme marqueur du noyeau, du cyto, de la membrane plasmique, du RE, des differents organelles etc....
    3) qu'est ce qu'il existe comme autres fluorochrome aue la GFP?
    4) Qu'est ce que sont les molecules tels que HOECHST, DAPPY? Apparement ça colore le noyeau... est ce que je peux par exemple utiliser ce genre de traitement sur mes protoplats qui expriment aussi ma fusion proteine-GFP? Est-ce que je peux utiliser ce genre de molécule sur des proto vivant? Existe t-il des molecules de ce genre (j'entends, qui ne necessite pas de faire des proteines fusion) pour marquer d'autres choses que le noyeau (membrane, organelle...)
    5) et les tecniques d'immunodetection, c'est possible? Dans ce cas la, faut-il que j'utilise des anticorps dirigés contre les marqueurs dont je parle dans la question 1? Qu'est-ce qui ce fait en routine dans ce type d'approche?
    Puis-je combiner toutes ces approches en même temps? Merki bcp!!!! J'ai besoin de votre aide...

    -----

  2. #2
    Yoyo

    Re : determiner la localisation subcellulaire d'une proteine végétale

    UNe chose a la fois!

    La premiere chose a faire est de faire une coloration au DAPI en parallele a ta fluorescence. ensuite le principe est de superposer les deux images pour déterminer si ca colocalise.
    Le mieux est encore d'avoir un microscope qui est capable de prendre des images en différentes coupes dans l'epaisseur ce qui permet une reconstitution 3D de la cellule (mais tout le monde n'en n'a pas )

    Une fois que tu as fait ca si tu as besoin d'une localisation plus précise, alors le mieux est l'immunofluorescence en utilisant des anticorps reconnaissants des protéines présentent spécifiquement dans les différents compartiments.

    Voila ce que je peux te dire, peut etre que des spécialistes te donneront des details plus précis.

    Yoyo

  3. #3
    Jean-Luc P

    Re : determiner la localisation subcellulaire d'une proteine végétale

    Citation Envoyé par katiaestelle
    2) Qu'est ce qui est utilisé en routine comme marqueur du noyeau, du cyto, de la membrane plasmique, du RE, des differents organelles etc....
    noyau : DAPI ou Hoechst

    mitochondie : sensible au potentiel membranaire
    Rhodamine 123, DiOC6(3), DiOC7(3),
    JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-fixation possible)

    réticulum endoplasmique:
    (non spécifique) DiOC6(5)

    Pour le Golgi en général on utilise des protocoles avec la brefeldine A.

    en plus tu dois bien avoir des marqueurs de vacuole, (genre eosine ?)...
    Jean-Luc
    La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
    Salvor Hardin

  4. #4
    Noun

    Re : determiner la localisation subcellulaire d'une proteine végétale

    Cet article (gratuit) peut t'aider a repondre aux questions 1a 3

    Dixit, Ram, Cyr, Richard & Gilroy, Simon
    Using intrinsically fluorescent proteins for plant cell imaging.
    The Plant Journal 45 (4), 599-615.

    Noun

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