Bonjour,
je dois ajouter un peptide signal dont la séquence fait 70 bp à la CFP. Comment dois-je procéder? J'ai pensé faire 2 PCRs, une pour amplifier le peptide signal et une pour amplifier la CFP puis de faire une troisième PCR qui me permette de fusionner la cfp et le peptide signal. Mais j'ai peur de ne pas réussir a amplifier et purifier facilement mon peptide signal seul par PCR. est-ce possible? sinon est-ce que quelqu'un a déjà fusionné un signal peptide a une protéine?
Bonjour,
Dans ce cas, le plus simple et efficace est effectivement de passer par la PCR.
Mais deux seulement suffisent. La premiere, qui amplifie le peptide signal, avec sur une des amorces un site de restriction (cohesif), que tu rajouteras egalement sur le sequence de la CFP de la meme maniere (sauf bien sur si c'est une CFP "commercial", avec deja un bon choix d'enzyme qui coupe ou il faut).
Tu peux ensuite purifier tes fragments, les digerer, les repurifier puis faire le clonage (transformation, amplification, verification) et hop, le tour est joue. Durer moyenne pour un tel clonage : une semaine max, sans compter le temps necessaire pour commander les amorces...
tres bien, merci beaucoup pour ce conseil!
