An efficient TALEN mutagenesis system in rice

[inviteaa9cccbd]

Il y a cette partie que je ne comprends pas bien dans mon article pouvez vous m'aider ????

Generation gene knockout mutants and screening

To generate knockout mutants, Agrobacterium-mediated transformation of the rice cultivar Nipponbare is performed according
to Hiei et al. [57]. Usually, 40–50 transgenic lines per TALEN pair are regenerated in order to obtain targeted mutants. Genomic
DNA from individual hygromycin-resistant plants is extracted using a DNA Quick Plant System (Tiangen). The same PCR/RE digestion assay used in the protoplasts is applied to screen for transgenic lines (Fig. 4A). Candidate mutants are further confirmed by DNA sequencing (Fig. 4B). If the TALEN activity is efficient enough, mono allelic mutations are observed in most cases, but in some cases bi-allelic mutations can also be obtained in T0 plants, particularly when the TALEN activities are high.
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[inviteaa9cccbd]

Qui a une idée sur la relation du PCR avec l'analyse d'activité de TALEN dans les protoplastes du riz

[noir_ecaille]

TALEN, acronyme : transcription activator-like effector nuclease

[inviteaa9cccbd]

Ouii MEerci je sais ce sont des enzymes de restriction c'est plus compliqué que ça c'est un article que je dois présenter mais il y a vraiment quelques parties que je comprends pas

[A voir en vidéo sur Futura]

[JPL]

Fusion de cette discussion avec un message isolé.

[noir_ecaille]

"Pour produire des mutants KO (NDLT : inactivation d'un gène ou d'un locus), la transformation du cultivar de riz Nipponbare, par vecteur Agrobacterium, est pratiquée selon (la méthode ?) Hiei et al.. Habituellement, 40 à 50 lignées transformées via TALEN d'appariement sont reproduits afin d'obtenir les mutants désirés. L'ADN chromosomique (hors plasmides, etc.) provenants des individus/plants résistants à l'hygromycine est extrait avec une méthode/kit rapide spécifique pour plantes (ex : Tiangen^TM concernant l'équipe qui publie). La même méthode de digestion par PCR / enzymes de restriction que pour les chloroplastes est appliquée pour scanner les lignées transgéniques (Fig. 4A). Les mutants candidants seront davantage confirmés par séqençage ADN (Fig. 4B). Si l'activité de la TALEN s'avère suffisamment efficace, on observera des mutations mono-alléliques pour la plupart des cas, mais dans quelques cas on peut obtenir des mutations double-allèles dès les plants T₀ (NDLT : de génération zéro, ceux qui sont transformés avant croisement), particulièrement pour/avec des TALEN hautement actives."

PS : Par respect du droit d'auteur et en accord avec la charte FSG, toute citation doit être assortie de sa source.

[inviteaa9cccbd]

Vraiment c trééééééés gentiiil tu m'as vraiiiment aiidé (^_^)

[noir_ecaille]

De rien

[inviteaa9cccbd]

Est ce que vous avez une idée si la PCR/RE C'est PCR real time ??

[noir_ecaille]

Là sans le contexte (article source), aucune idée Mais ça ne me semble pas nécessaire tel quel.

La RT-PCR ou encore qPCR sert comme son deuxième nom l'indique à quantifier, alors que dans le passage traduit ils s'attachent d'abord à la détection des mutants. Peut-être que les mutants double-allèles sont détectés pas qPCR mais ça peut aussi être plus empirique -- par croisements des différentes lignées candidates.

Étant donné qu'il s'agit de lignées KO, il n'y a pas forcément similitude des allèles -- ces mutants doubles-allèles ne sont pas forcément homozygotes, donc une qPCR ne verrait pas forcément quelque chose de plus que la PCR classique.

[inviteaa9cccbd]

Ouii T'a raison il s'attache à la détection des mutation.
L'article que j'ai comporte plusieurs paragraphes dont le titre c'est "PCR/RE assay" je cherche et je ne trouve vraiment rien
3.3.4. PCR/RE assay
1. Digest 10 lL of the genomic DNA with the preselected restriction enzyme in a 20 lL reaction volume. This step is optional for TALEN pairs with high cleavage efficiencies.
2. Using 8 lL of the restriction digest (or 5 lL of genomic DNA) as template (in 25 lL reaction volumes), perform PCR to amplify the chromosomal fragment encompassing the target site. We
recommend primers that can amplify a 300–500 bp fragment encompassing the target site, which can be easily identified on a 1.5% EB gel after digestion.
3. Digest 10 lL of the unpurified PCR mixture with the specific restriction enzyme in a 50 lL reaction volume for 1–2 h.
4. Resolve the digested products by electrophoresis on a 1.5% agarose gel, loading the intact PCR products and completely digested products of the wild type as controls. A characteristic
pattern should be observed (Fig. 3), and the mutations created by TALENs appear as undigested PCR products (Fig. 3).The frequency of TALEN-mediated mutagenesis is measured by quantifying
the percentage of undigested PCR products.
5. Excise the restriction enzyme-insensitive fragments of the same size as the undigested DNA fragment, and purify them with a DNA gel Extraction kit as described by AXYGEN.

[noir_ecaille]

Que cherches-tu en fait ? Ce que veut dire "PCR/RE assay" ? Auquel cas c'est "méthode PCR/RE". Dans le contexte, son utilisation c'est pour le séquençage.

Je suppose que les séquences ciblées par les enzymes de restrictions participent du transgènes, auquel cas on digère la séquence ADN et on regarde ce que ça donne par PCR pour détecter les inserts.

[inviteaa9cccbd]

ça y est ce que tu m'as donné c'est le principe et c'est ce que j'avais besoiin d'éclaircir merciiiiii beaucoup car je savais pas c'est quoi"RE" mais en général c'est la méthode
MERCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII milles fois

[noir_ecaille]

De rien

[inviteaa9cccbd]

A ton avis ici on va confirmer la mutagénèse ?? ou quoi??
3.3.5. Confirming mutagenesis
1. Clone the mutant fragments into sequencing vector pUC-T according to the manufacturer’s protocol.
2. Transform 50 lL of DH5a competent cells with 5 lL ligation mixture per reaction following the manufactures’ instruction.
Spread the transformed E. coli on LB plates with Amp (100 lg/L), IPTG(20 lg/L) and X-gal (40 lg/L) and incubate in a 37 C
incubator overnight.
3. Pick 30–50 white colonies from each plate and perform colony PCR, then select correct clones for the overnight culture.
4. Miniprep the plasmids and confirm the correct colonies by repeating the restriction enzyme digestion, but the digestion time can be shortened to 5–10 min.
5. Send the clones containing restriction enzyme-insensitive inserts for confirmation by DNA sequencing.

[noir_ecaille]

Oui, carrément Surtout que la séquence insert est ici connue pour ne pas être sensible aux enzymes de restriction, donc à la digestion elle apparaîtra clairement.

[inviteaa9cccbd]

ce que vous avez dit peut être l'idée générale de ce paragraphe ???

[noir_ecaille]

En très raccourci.

[inviteaa9cccbd]

Merciiiiiiiiiiiiiiii c'étaiiit gentiiil tu m'as vraiment aidé grâce à toi j'ai avancé j'étais vraiment bloqué

[inviteaa9cccbd]

La dernière question je vais rien ajouté aprés ^^ je veux juste savoir l'idée générale de ce paragraphe
Although TALEN technology benefited from the discovery of the DNA recognition code of TALEs, which originated in a plant pathogen, the application of TALENs to plants is far behind that to other organisms. Here we present a simple and efficient protocol for performing TALEN-induced mutagenesis in rice. Using this protocol, our group has knocked out 52 rice genes and established a platform for large-scale TALEN mutagenesis. Instead of a laborious plant transformation procedure, we use a rapid, accurate and reliable protoplast transient assay, based on PCR/RE digestion, to quickly screen nuclease activity independently at each endogenous target site [34]. The active TALENs are subsequently transformed into embryonic cells of rice using the Agrobacterium transformation method. Mutation rates reach > 30% as measured by PCR/RE assays
and by sequencing. The mutant sequences we have identified contain contain small deletions and insertions. Most mutations are small deletions ranging from 1 to 20 bp, and they often occur in the spacer region between the TALEN binding sites [34]. With this protocol, the PCR/RE assay cannot be applied to a target locus if no restriction site is found in the spacer region. As an alternative, a mismatch digestion enzyme such as T7 endonuclease or CEL1 might be used. In addition, large deletions can be obtained by co-transforming two pairs of TALENs targeting the same chromosomes by the particle bombardment method. Although off-target effects of TALENs have not so far been reported in rice, we nevertheless suggest testing carefully for off-target mutagenesis at potential homologous sequences, if possible. Also whole genome sequencing may be necessary to confirm the linkage between artificial genotyping and TALEN mutants in some important cases.
In summary, TALEN technology is a powerful and adaptable approach to genome editing in plants. TALEN mutagenesis in rice provides an efficient and robust way to create mutants for reverse genetics research.
J'ai compris mais pour savoir le principe que je dois prendre pour le présenter j'ai trouver probléme :'(
Merciii d'avance

[noir_ecaille]

C'est dense. En fait il faudrait plus une traduction car je relèves plusieurs "idées générales" ou plutôt points clefs.

Qu'as-tu relevé ? ou bien est-ce qu'il y aurait des points qui te bloque spécifiquement ?

[inviteaa9cccbd]

Est ce que vous pouvez me donner ces points clefs ??
Ils disent que La technologie TALEN est puissante et adaptable mais quel est sa relation avec la génétique inverse
les résultats du protocole non plus ils réexpliquent c'est pourquoi je ne sais pas quoi prendre
J'aii juste besoiin de l'essentiel que je ne sais vraiment pas c'est quoi

[inviteaa9cccbd]

c'est comme une conclusion que je veux donner sans tout citer une autre fois

[Syst.]

noir_ecaille ne devrait pas non plus faire tout votre boulot ^^"

[noir_ecaille]

En gros la méthode de transformation par transfect bactérien chez les plantes est relativement plus efficace/rapide que d'autres méthodes. Utilisé sur des cellules végétales embryonnaires, le taux de mutation constaté dépasse les 30%.

(NDLR) Mais....

On constate également que la transformation s'accompagne à la fois d'inserts et de déletions de quelques pb. Apparemment ça correspond aux régions nucléotidique où se lie une TALEN donnée.

(NDLR) Donc....

Pour pouvoir utiliser ce protocole, il faut s'assurer que le site de restriction de la TALEN ne tombe pas n'importe où dans un locus critique (ciblé ou non), ou encore que le locus cible est porteur d'au moins un site de restriction, de préférence dans de l'ADN non codant (NDLR : et probablement non-promoteur non plus), sauf à vouloir réaliser des cultivars KO.

+ quelques autres détails.


Par contre il vaudrait mieux que tu fasses ta propre synthèse, et qu'éventuellement des corrections y soient apportées après coup si nécessaire.

[inviteaa9cccbd]

Ouii ça y est c'est déjà fait merciiiiiiiiiii milles fois pour votre aide ^_^