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[sarason]

Bonjour les biochimistes,

A l'aide svp J'ai déjà fait des SDS PAGE à la pelle mais durant un stage dans un laboratoire ou tous les tampons et produit sont déjà pret et je n'ai eu aucun problème . Cependant, là je suis dans un autre labo ou il faut tout préparer moi même. Et ouuups mon gel ne polymérise pas
1. L'acrylamide on l'a à 40% que j'ai ramenée à 30%. Le bis-acryl on l'a en poudre. J'ai juste mélangé les deux (29.1) et agité. Faut il chauffer ou filtrer par hazard?

2. Les tampons tris SDS Glycine. pour ajuster le pH à 8.8. Faut il ajuster le pH du tris d'abord ensuite y ajouter la glycine et l'sds et revérifier le pH de nouveau? Ou bien mélanger le tout et régler le pH une fois pour toute (comme j'ai fais dans mon stage quand le tampon est fini .. et tout marchait très bien).

3. Recette du tampon de charge (BBT, glycerol, SDS, beta mercapto) faut il aussi chauffer et filtrer ? CONCERVER à 4° ou à 20°?

4. Je prépare toujours mon APS le jour même. Et si la poudre d'APS est ancienne? ou bien mon TEMED? celà peut il être cause de la non polymérisation de mon gel?

Si non quels sont vos avis ? Pourquoi mon gel ne polymérise pas?

Merci infiniment
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[biseibutsu]

Bonjour,

Pour le point 1. il ne faut pas chauffer. Tu peux filtrer si tu le veux, mais ce n'est normalement pas nécessaire. Vu que l'acrylamide est toxique, les petites bêtes ne peuvent pas vivre dedans. Il faut comme même stocker la solution acrylamide/bis à 4 degrés celsius à l'abris de la lumière.

pour le point 2, il faut préparer le tampon (avec tout les composants), avant d'ajuster le pH. Attention au volume nécessaire d'acide (HCl) qui peut être important! Encore une fois, il ne faut pas chauffer (sauf s'il a fait très froid dans le labo et que le SDS à précipité, dans ce cas il faut chaffer à 50-55 degrés jusqu'à dissolution du SDS). Tu peux filtrer, mais ce n'est pas nécessaire (le SDS va tuer toute les petites bêtes). Le Tris a un pouvoir tampon fort, surtout à forte concentration, mais la glycine a aussiun pouvoir tampon (plus faible, certe). Si la concentration du tampon Tris que tu utilises dans ce gel est plus faible, cela peut induire des variations de pH (mais n'a pas d'impact sur la polymérisation normalement).

Pour le tampon de charge, il est plus stable sur de longue période à -20. Pas besoin de filtrer (de toute façon, avec du glycérol dedans, cela ne va pas être facile), et normalement, tu le fais chauffer avec les protéines juste avant le dépôt. Et dans tout les cas, ce composants n'a aucun rôle dans la polymérisation du gel.

Ce qui joue un rôle dans la polymérisation est bien le couple APS-TEMED. Les deux sont sensibles à la lumière, les garder à l'abri dans l'obscurité est mieux. On stockait la poudre d'APS à 4 degrés dans mon ancien labo, Température ambiante dans le nouveau. La solution stock d'APS (10%) était ensuite soit stocké en aliquot à -20, soit à 4 degrés, suivant la date d'utilisation. Mais tu te fiche de ce détail, vu que tu le prépares juste avant. Pour le TEMED, stockage à température ambiante à l'abri de la lumière. Et bien fermé, vu que cela put le poisson pourrit.
Une concentration trop faible d'un des deux composants empechera la polymérisation. Si les solutions sont un peu (ou très) vieille, le composé actif est moins présent, et il faut en mettre plus. Je te conseillerai donc d'augmenter les concentrations finales de APS et TEMED.

Ah, aussi, l'oxygène inhibe la polymérisation du gel. D'où l'utilité de sceller le haut du gel avec de l'isopropanol, par exemple (ou du butanol).

Enfin, il n'y a pas que la polymérisation chimique qui est possible pour les gels de polyacrylamide. La polymérisation par UV fonctionne bien également (en remplassant l'APS et le TEMED par de la riboflavine par exemple).

[sarason]

Merci beaucoup ça a marché en doublant la quantité d'APS

[sarason]

Re-salut!
J'ai une autre question svp; est ce que je dois arreter forcément le run quand la ligne bleu (du tampon de charge) atteint le front bas des plaques de verre?
J'ai fait ça deux fois mais j'obtient des bandes serrée en haut. On dirait qu'il n'ont pas traversé tout le gel...

ps : le générateur de courant que j'utilise est ancien type BIO-RAD 500/200 power supply. Et je ne suis pas sur que l'aiguille indique le voltage désiré..

Mais cela veut rien dire car le bleu est sorti non?

help again please

Je vous joint une photo du gel que je obtenais avant dans un autre labo...Et maintenant avec les bandes bloquées en haut du gel (les bandes intenses doivent etre au milieu du gel normalement)

Merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

vous n'avez pas un marqueur pour vous aider a estimer la migration ?

[sarason]

Non pour le moment je n'ai pas encore de MT...

[biseibutsu]

Re-bonjour
Il y a pour moi clairement un problème de migration.

Le pourcentage en acrylamide entre les deux gels est bien le même?
Il est bien sur possible de laisser migrer plus longtemps (ou beaucoups plus longtemps) afin de mieux séparer les grosses protéines. Mais en faisant cela, on perd les protéines de faibles poids moléculaire... Il faut donc trouver un juste milieux...

Enfin, avez vous un moyen afin de voir le nombre d'ampère que le générateur délivre (car les gels se foont généralement à voltage constant et ampérage flottant), et enfin, un moyen de vérifier la puissance distribué par le générateur (et voir si celle-ci varie fortement pendant la migration)?

[sarason]

Bonjour,

Merci pour votre réponse. Oui les deux gels ont exactement la même concentration. En fait je suis entrain d'appliquer ce que j'ai appris..Sauf que je l'ai préparé moi même mon acrylamide comme j'ai expliqué ds le message ci-dessus..

Je ne suis pas sur de ce que affiche les aiguilles de A et V..En plus elles sont pas stables ..Elles bougent un peu surtout celle du Voltage. Je la fixe à 120 et elle monte parfois à 200 et redescend..Je vais voir un électricien pr vérifier le vrai voltage;

Mais pouvez vous me dire svp pourquoi le voltage doit etre stable tout au long de l'électrophorèse?

On ne peut pas commencer par 100 par exemple et ensuite remonter à 120v (comme ds les gels d'agarose et Migration d'ADN?)

merci bcp

bonne journée

[biseibutsu]

Il peut en effet être utile de faire vérifier le matériel par un électricien, surtout si vous avez des doutes.

Vous pouvez bien entendu faire varier la tension pendant la migration (une pénétration des protéines en douceur dans le gel, suivit d'une migration plus énergique).

Sinon, niveau électrique, il y a troi paramètres à prendre en compte :
la tension, en volt
l'ampérage, en... Ampère
et la puissance, en Watt. Sachant que la puissance est juste le rapport V*A

De manière plus pratique, le voltage va déterminer la vitesse de la migration des protéines (et ions) dans le gel. L'ampérage lui indique la résistance électrique qu'impose le gel (et également la chauffe du matériel). Si il n'y a pas d'ampère détecter (ce qui ne veut pas dire qu'il n'y en a pas), le matériel n'est pas/peu conducteur. Donc pas de migration des protéines. Les ampères ne varient normalement pas beaucoup dans un gel (sauf si celui-ci présente des dépots solides de sels, qui s'assechent...). Bref, si au départ de la migration, les ampères sont "normaux", et que à la fin de la migration, ils sont indétectables, c'est que le courant ne passe plus, ou a tellement ralenti qu'il ne fait plus migrer les protéines (ou très peu).
Mais si c'est le cas, on en revient à la proposition de départ : faire appelle à un électricien pour régler le problème.

[sarason]

Il s'agit effectivement du générateur qui déconne !

Merci