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Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.



  1. #1
    lilou41

    Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.


    ------

    Bonjour!

    Je réalise un clonage et j'ai un grand souci.
    J'ai effectué une PCR pour avoir un fragment de 3.3 kb qui est un rolling circle plasmide de Pediococcus damnosus.
    J'ai utilisé le High Fidelity PCR système afin d'avoir des A aux extrémités 3'.
    Ensuite j'ai mis sur gel et j'ai purifié la bande par nucleospin extract II. J'ai vérifié sur gel mon produit purifié et c'est ok j'ai ~30 ng/ul.

    Je souhaite ensuite cloner ce produit PCR dans le pGEM-T easy vecteur. J'ai suivi le protocole de ligation en faisant des ratios molaires insert-vecteur de 1:2 et 2:1 ainsi que les contrôles indiqués.
    J'ai laissé une heure à température ambiante pour la ligation (le kit du pGEM-T est tout nouveau, je suis la 1ère à utiliser, il a été stocké direct à -20 °C)

    J'ai ensuite réaliser une électroporation avec des E.coli XL1-Blue MRF électrocompétentes.
    Un souci déjà est arrivé lors de l'électroporation, car j'avais chaque fois un Arc noté sur la machine (micropulser Bio-Rad).
    Je n'ai pourtant mis qu'1 ul de ligation et 40 ul de cellules.
    J'ai dilué 10 x et réessayé, mais là encore Arc. J'ai alors dilué 100x et cette fois ça a fonctionné pas de Arc (trop de sel ou trop d'ADN car ligation a trop bien fonctionnée?)
    J'ai mis directement du milieu SOC et incubé à 37 °C 1h à 300 rpm. J'ai concentré les cellules avant d'étaler sur plaques.

    J'ai ensuite mis sur plaques avec 100 ug/ml d'ampicilline, 80 ug/ml de X-Gal et 0.2 mM d'IPTG et incubé à 37°C.

    Déjà une chose, ça a pris plus de temps que d'habitude pour avoir des colonies. Le contrôle positif fait avec un de mes vecteurs et les cellules a donné des colonies après une nuit (normal). Pour mes plaques de transformation, j'ai du attendre 1 jour pour avoir des coloniees bien visibles. Le background control ne contenait aucune colonie et le positive control de promega a donné 14 colonies uniquement blanches.
    J'ai repiqué 10 colonies blanches sur de nouvelles plaques et après une nuit, ça a repoussé.
    J'ai mis ensuite une colonie dans du milieu LB liquide avec que de l'ampicilline 100 ug/ml (donc 10 cultures au final).
    Après 1 nuit à 37 °C normalement, ça pousse généralement bien E.coli. Mais dans ce cas, j'ai du attendre 1 jour et demi pour avoir une culture trouble. J'ai réalisé l'extraction avec le kit de promega SV wizard minipreps.
    J'ai regardé au spectrophotomètre et les résultats ne sont pas terribles. L'absorbance à 260 nm n'est pas très haute (alors que j'avais un assez grand pellet) et à 280 nm, c'est haut! J'ai un rapport moyen entre 260/280 nm de 1.3. C'est vraiment mauvais. Et cela pour les 10 cultures. J'ai quand même effectué une restriction et j'ai également mis sur gel un grand volume de l'ADN extrait non digéré.

    Et qu'est-ce que j'ai obtenu??? Rien!! Sur le gel, je ne vois absolument aucune bande!! Je ne vois que le marker!

    Comment est-ce possible d'avoir des colonies blanches (qui restent blanches après +sieurs jours au frigo) et de ne pas avoir d'ADN plasmidique dedans?

    J'ai relu le protocole pGEM-T easy et dans le troubleshooting, c'est écrit que si la réaction de ligation avec le produit PCR ne donne que des colonies blanches (pas de bleues) c'est parce que l'ampicilline sur les plaques était inactif. Je suis en train de me demander si l'ampicilline que j'ai utilisé était encore bon. Je l'ai préparé mi-spetembre et jusqu'à ce que je l'utilise, il est resté à -20 °C. Vous pensez que l'ampicilline n'était plus bon (le X-Gal est ok et l'IPTG aussi)?

    Ce qui me semble étrange, c'est que si l'ampicilline était vraiment inactif, j'aurai du obtenir beaucoup plus de colonies sur mes plaques de contrôles et de transformation (en moyenne 40 colonies obtenues). Mais j'ai vraiment du mal à comprendre comment c'est possible d'avoir les colonies blanches et de n'avoir aucun ADN plasmidique sur le gel ensuite?

    Devrais-je essayer de faire des nouvelles plaques avec de l'ampicilline frais et de reprendre la même ligation (j'en encore suffisamment) pour faire à nouveau l'électroporation ou dois-je refaire entièrement la ligation?

    Fin du paraphe! Je suis désolée d'avoir été si longue, mais il fallait que j'explique au maximum!

    Toutes vos suggestions sont bienvenues! Merci!

    -----

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  3. #2
    Yoyo

    Re : problème de clonage dans le pGEM-T easy vector! HELP

    Salut

    Tu es sur que ton kit de PCR rajoute les "A" a la fin de ton produit? car les enzymes fideles creent des fragments blunt end! (je ne connais pas ce kit)

    Sinon pour l'ampicilline, si tu l'as fait en septembre, qu'il est resté a -20° alors c'est stable pas de probleme. Je pense que ton probleme est plus au niveau de l'électroporation, generalement la presence d'un arc n'est pas bon signe.
    As tu la possibilité d'essayer une transformation par choc thermique ?

    Sinon une possibilté est que tes colonies soient une contamination.

    YOyo

  4. #3
    lilou41

    Re : problème de clonage dans le pGEM-T easy vector! HELP

    Pour le kit oui c'est sûr qu'il rajoute des A. Le fait d'avoir un Arc m'est déjà arrivé précédemment lors d'un tout autre travail et en diluant ma ligation, ça règle le problème. Ensuite, j'ai eu des clones positifs. Donc je ne pense pas que ce soit un problème. Par contre, par choc thermique, ce ne serait pas idéal dans ce projet. Et je sais que ça a déjà fonctionné avec le pGEM-T pour d'autres avec un insert de la même taille avec l'électroporation.
    J'ai contrôlé sous miscroscope mes 10 cultures et j'ai bien des E.coli, donc pas de contaminations.

    L'ampicilline a été fait en mi-septembre, mais plusieurs tubes ont été faits et je pense que c'est possible que d'autres aient utilisés en partie (donc ça a été dégelé et recongelé, peut-être dans ce cas un problème).

    J'ai bien de la peine à comprendre pourquoi je n'ai pas d'ADN plasmidique après extraction.

  5. #4
    piwi

    Re : problème de clonage dans le pGEM-T easy vector! HELP

    A mon avis ce qui c'est passé c'est surtout que votre transformation a foiré et que des bactéries ampi résistantes vides ont poussé quand l'ampi a commencé a devenir limitant.
    Je n'ai jamais utilisé de bactéries éléctro compétentes donc je ne peux pas vous aider à optimiser vos transformation. J'ai une grosse préférence pour les chimio compétentes.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  6. #5
    lilou41

    Re : problème de clonage dans le pGEM-T easy vector! HELP

    Encore une petite chose par rapport à l'Arc qui est arrivé lors de l'électroporation. Le background control de promega était ok, pas d'Arc. Par contre, LEUR contrôle positif avec les 2 ul de leur ADN à insérer m'a donné un Arc. Je ne comprends pas pourquoi vu que j'ai juste suivi le protocole. J'ai purifié ma ligation des éventuels sels présents et j'ai refait l'électroporation et de nouveau Arc. Ce n'est que lorsque j'ai dilué 100 x le contrôle positif que je n'ai plus eu d'Arc. Il semblerait que ça soit un problème de concentration d'ADN...?? Mais comment leur contrôle positif pourrait être trop concentré?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    dezmounaa

    Re : Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

    bonjour svp aider moi je suis perdu,

    j-ai les enzyme de restriction BamHI,EcoRI et PstI ,COMMENT SAVOIR ESQ CES ENZYMES ONT DES SITES DE RESTRICTIONS POUR LE PLASMIDE pGEM-T ET SI C-EST OUI COMBIEN DE SITE??? SVP DES REPENCES SONT LES BIENVENUE

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  10. #7
    JPL

    Re : Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

    Rappel de la charte du forum :

    Évitez les majuscules pour attirer l'attention des lecteurs.
    Rien ne sert de penser, il faut réfléchir avant - Pierre Dac

  11. #8
    franckeeuuhh

    Re : Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

    Bonjour,

    J'utilise le gene-pulser très régulièrement sur des bactéries ou des parasites que je veux transfecter et à chaque fois que j'ai eu de problème d'arc c'était surtout du à la présence de bulles dans mes cuvettes d'electroporation ou alors d'eau résiduelle sur les plaques conductrices à l'extérieur.
    J'ai toujours solutionné le problème en tapotant la cuvette pour faire remonter les bulles et en essuyant les bords de la cuvette pour la sécher et ensuite plus d'arc et la transfo/transfection a toujours été un succès.
    Je tiens à préciser que j'ai utilisé beaucoup de buffer différents et que j'ai jamais diluer pour ça fonctionne.

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