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Hybridation Southern Blot



  1. #1
    Bio-Mic20

    Hybridation Southern Blot

    bonjour

    svp quelqu’un peut me passer le protocole de la technique hybridation !! ,je vais l'utiliser avec les produits PCR 16s et d'un gene de resisitance (X),le kit c'est "quiaquick PCR purification"
    c urgent j'ai besoin du protocole ordinaire !! pour comprendre de quoi il s'agit merci
    merci

    -----


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  3. #2
    Flyingbike

    Re : Hybridation Southern Blot

    Citation Envoyé par asma.gad Voir le message
    bonjour

    svp quelqu’un peut me passer le protocole de la technique hybridation !! ,je vais l'utiliser avec les produits PCR 16s et d'un gene de resisitance (X),le kit c'est "quiaquick PCR purification"
    c urgent j'ai besoin du protocole ordinaire !! pour comprendre de quoi il s'agit merci
    merci
    Il va falloir être plus précis parce que la on ne comprend pas ce que vous voulez.

  4. #3
    Bio-Mic20

    Re : Hybridation Southern Blot

    bonsoir
    je veux savoir le protocole de la technique hybridation!.j'ai réalisé la technique Southern blot avec des échantillons des bactéries résistante à la betalactamine,je voulais detecter la localisation du gene de résistance en question , donc je dois procédé a faire une hybridation ,je veux savoir de quoi il s'agit exactement,le principe ,un protocole classique pour comprendre ce que je devrais savoir(c'est pour mon mèmoire).
    merci

  5. #4
    noir_ecaille

    Re : Hybridation Southern Blot

    Vous parlez d'hybridation avec la sonde ? C'est le principe clef de cette technique : on crée une sonde taggée (avec un radio-isotope ou un fluorophore) qui cible la séquence d'intérêt. La sonde s'hybride avec la séquence cible, on lave le gel de l'excédent de sondes, puis on redarde où s'est hybrider la sonde relativement sur le gel.

    Hybridation ==> complémentarité des séquences sonde et cible.
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

  6. #5
    Bio-Mic20

    Re : Hybridation Southern Blot

    et la sonde specifique a ce gene ,comment je la choisie !! une sequence complèmentaire a la sequence de gene(que je cherche)? ses specificitè ?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    noir_ecaille

    Re : Hybridation Southern Blot

    Pour le protocole de base du Southern Blot, les étapes de la méthode sont présentées sur Wikipédia : http://fr.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

    Si vous connaissez la séquence de votre gène d'intérêt ==> design de la sonde


    Si c'est pour connaître la séquence de ce gène et sa position... A priori vous parlez d'un gène de résistance. Pourriez-vous nous en dire plus ?

    a) S'il s'agit d'une variation génétique/"allélique" d'un gène séquencé, en designant la sonde selon le gène sauvage, vous aurez tout de même une hybridation "hétéroduplex" (incomplète/imparfaite), mais pour une détection par SB ça devrait suffir.

    b) S'il ne s'agit pas d'une variation d'un gène connu mais d'un gène spécifique de résistance, mes connaissances sont bien trop modestes pour vous éclairez.


    J'imagine que dans le cas d'un gène spécifique (ex : enzyme s'attaquant à un antibiotique ou créant un repliement particulier sur d'autres protéines), on peut effectuer une RT-PCR à partir des bactéries cultivées en condition de résistance ? On procèderait ensuite à une migration sur gel d'agarose et on repère les bandes de forte expression. On remet tout ce petit monde en solution, on élimine avec des sondes (micro-array ou autre technique) les séquences qu'on connait et qui correspondent à des protéines ne nous intéressant pas, et s'il reste encore quelque chose, on le séquence ?

    Sans préjuger de ce qui a été fait de votre côté et sous réserve de confirmation/correction par plus compétent que moi.
    Dernière modification par noir_ecaille ; 20/10/2014 à 01h47.
    "Deviens ce que tu es", Friedrich W. Nietzsche

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