Bonsoir

Etes vous d'accord avec cette démarche pour trouver l'activité spécifique dune enzyme ?
bonjour!
Je cherche à déterminer l'activité spécifique d'une enzyme x sur son substrat ( Activité spécifique = activité enzymatique / masse protéines (mg).

Indications : Volumes réactionnels de 2mL. Coefficient d'extinction molaire du produit à 410nm : 2500M.cm^-1

Les expériences ont été réalisées en présence de 50microlitres de solution mère enzymatique
Dosage de la solution mère d'enzyme : Après dilution au 1/20ème Abs280 = 0,128
Coeff d'extinction molaire de l'enzyme à 280nm : 6400 M.cm^-1
masse moléculaire de l'enzyme : 85000Da


On me donne dans les indications l'absorbance de la solution d'enzyme diluée. J'en déduis la concentration en enzyme diluée
[enzyme]diluée = (50microlitres*4.10^-5)/2.10^3 = 1.10^-6 M
La solution d'enzyme mère est 20 fois plus concentrée donc [enzyme]mère = 20*(1.10^-6M) = 2.10^-5 M

J'ai déterminé dans des questions précédentes que la Vmaximale = 7,6mM.sec


On a 7,6mM de produit formé par seconde par 50microlitres d'enzyme à 20micromolaire, on a également 7,6mM de substrat consommé par seconde ( je suppose que la stoechiométrie de la réaction est de 1 -1 car je n'ai aucune indication ! )


[ enzyme ]mère = 20micromol pour 1L de solution enzymatique . Or,on en prélève 50microlitres

( (50*10^-3mL )*20microM ) / 1000 = 0,001 micromol

On a donc 7,6 mM de substrat consommé par 1 nmol d'enzyme

on a 7,6mmol de substrat consommé par litre. or, le volume réactionnel fait 2ml

( 7,6mmol * 2.10^-3L ) = 0,0152 mmol = 15,2 nmol

On a 15,2 nmol de substrat consommé par seconde par 1 nmol d'enzyme.



Activité spécifique = (15,2.10^-9 ) / masse protéines (mg )

trouvons la masse de protéine en mg :

On me donne la Masse moléculaire de l'enzyme = 85000Da soit 85000g/mole

85000g -----> 1 mole
x g ---------> 1.10^-9 mole d'enzyme
soit x = 8,5.10^-5 g = 0,085 mg

soit Activité spécifique = (15,2.10^-9) / 0,085 = 1,78.10^-7 mole de substrat consommé par sec par mg d'enzyme = 17,8microkatal/mg

je vous remercie

bon weekend