Produit PCR / microsatellites

[invite370030b4]

Bonjour à tous !

Je suis actuellement en train de travailler sur l'amplification de régions mitochondriales à partir d'ADN dégradé (extraction sur des os) et j'ai un problème en PCR. Quand j'ai testé mes primers en gel d'aggarose après amplification j'obtenais des bandes, certes pas très marquées mais tout de même visibles. Quand j'ai testé ces mêmes primers à plus grande échelle (nombreux échnatillons) en qPCR alors après 35 cycles j'ai la moitié de mes échantillons (dont mon contrôle positif dillué au 100e) qui ont une Cp supérieure à 30.. Même protocole utilisé je me dis que les échantillons sont pas assez concentrés.. Augmenter le ,ombre de cyles est il la meilleure solution ?

Autre question, j'essaie d'amplifier ces régions avce pour objectif de faire de la génétique de populations d'un poisson. Je commence donc à designer des primers sur des régions nucléaires, mais mon superviseur m'a demandé d'éviter tout microsatellite et je ne comprends pas pourquoi. Est ce parce qu'ils sont très variables ? ils ont l'air d'être pourtant souvent utilisés en genet de pop ? (et le pourquoi je lui ai pas posé la question directement est qu'il est parti en mission et que en ce moment je suis seule sans personne pour m'aider ^^)

Voilà si quelqu'un peut me donner un coup de pousse ça serait génial, j'ai une formation en écologie et je suis novice en génèt/biomol

Bonne journée !!
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[invite4d04e446]

Ecoute pour la PCR je peux pas vraiment t'aider mais si tu peux je pense qu'augmenter le nombres de cycles pourra peut être te donner un meilleur marquage.. A voir franchement ça dépend de beacoup d'autres composants. Pour les ADN microsatellites tu dois savoir que c'est des séquences répétées en tandem. Du coup si tes extrémités ne sont pas des séquences uniques, ton marqueur sera trop ambigu !

[invite9dc7b526]

Difficile de savoir pourquoi ton superviseur ne veut pas que tu étudies des microsats. Soit il a essayé sur cette espèce et sait que ça ne marche pas, soit c'est du fait des propriétés générales des microsats. Ces marqueurs évoluent vite et de plus comme les mutations peuvent aussi bien augmenter que diminuer le nombre de répétitions, il y a beaucoup d'homoplasie. Bref ils ne sont utiles que pour étudier des événements récents. Si tu veux connaître l'histoire "ancienne" de ton poisson il vaut mieux étudier des gènes de ménage.