TP Activité bêta glucuronidase et stress des végétaux

[Meiosis]

Bonjour,

J'ai un problème de compréhension concernant un TP que nous avons consacré à l'étude des stress chez les végétaux (stress dû au froid et stress hydrique). Pour cela nous avons voulu étudier le degré d'expression d'un gène sous le contrôle du promoteur ABI1 et le gène rapporteur de la bêta-glucuronidase (bêta-glucuronidase abrégée ci-après GUS) a donc été utilisé et mis sous le contrôle de ce promoteur. Un dosage fluorimétrique a été utilisé avec comme substrat le MUG et comme produit le 4-MU. Le 4-MU produit de la réaction est fluorescent et peut être dosé.

Pour ne pas aller par quatre chemins j'ai extrait mes protéines GUS des 4 échantillons végétaux : un contrôle stress froid, un stress froid, un contrôle stress hydrique et un stress hydrique. Ensuite j'ai dosé ces protéines avec Bradford et j'ai trouvé des concentrations différentes. Ensuite j'ai tout ramené pour avoir une masse de 15ug de protéines GUS pour les 4 extraits, comme les concentrations sont différentes le volume n'a pas été le même pour atteindre 15ug. Bref dans chacun de ces 4 tubes j'ai rajouté du tampon phosphate et le substrat MUG. J'ai arrêté ensuite les réactions enzymatiques de transformation du MUG en 4-MU par la GUS à différents temps : 0 minute (donc j'ai mis du tampon d'arrêt de réaction directement), 10 minutes, 30 minutes et 1 heure.
Au final j'ai mesuré les fluorescences dans tous les tubes aux différents temps de réaction, donc il y avait 0 minute, 10 minutes, 30 minutes et 1 heure pour chacun des 4 échantillons (les 2 contrôles et les 2 stress).

Voici mes résultats (fluorescences en UA, unités arbitraires) :

Contrôle stress froid :
T=0min 0 UA
T=10min 568 UA
T=45min 568 UA

Stress froid :
T=0min 0 UA
T=10min 1704 UA
T=45min 2727 UA

Pas de 30min ni de 60min pour le froid mais 45min à la place, ça avait un peu raté, le protocole n'a pas été suivi à la lettre.

Contrôle stress hydrique :
T=0min 476 UA
T=10min 976 UA
T=30min 5476 UA
T=60min 8214 UA

Stress hydrique :
T=0min 833 UA
T=10min 6428 UA
T=30min 12 976 UA
T=60min 15 833 UA

Donc j'ai exposé la situation, maintenant c'est là que je ne comprends pas très bien.
J'ai bien une augmentation de la fluorescence avec l'augmentation du temps de réaction, cela est normal car si on laisse plus de temps alors l'enzyme GUS a le temps de plus transformer le substrat MUG en 4-MU, le 4-MU étant fluorescent alors la fluorescence augmente lors de la mesure.

Cependant le problème intervient quand je veux comparer les mesures de fluorescence entre le stress hydrique et le stress froid.
Le stress hydrique affiche des fluorescences beaucoup plus élevées que pour le stress froid, ce qui signifie qu'au bout d'un même temps de réaction il y a beaucoup plus de 4-MU qui a été produit par les GUS issus des échantillons qui avaient été stressés "hydriquement" que par les GUS issus des échantillons qui avaient été stressés par le froid, je ne comprends pas, en effet dans les 4 tubes j'avais mis 15ug de GUS (voir ci-dessus) donc normalement même quantité de protéine + même temps de réaction devrait aboutir à une même quantité de substrat transformé en produit donc au final à une même fluorescence ? La nature des protéines est la même, ce sont des GUS...

D'où vient cette différence de fluorescences beaucoup plus élevées pour les plantes stressées hydriquement ?

Merci pour votre aide car je ne vois vraiment pas.

Et désolé du pavé mais je pense que c'était nécessaire pour que vous ayez tous les éléments.
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[Meiosis]

Personne ne peut m'aider ?

[invite4d04e446]

En partant de mes connaissances de médecine, chaque enzyme fonctionne à une température... un ph .. optimale , donc ce serait pas tout simplement un problème d'optimisation? l'enzyme étant 'affaiblit' par le froid ?

[Meiosis]

Bah en fait la séance de TP s'est faite en deux fois, la semaine d'avant stress par le froid et la semaine suivante stress hydrique.
Sauf que les résultats de fluorescence que j'ai ont été obtenus avec des enzymes GUS issues des échantillons stress hydrique dans les deux cas, même pour l'étude du stress par le froid, car de toute façon les enzymes sont les mêmes donc peu importe d'où on les prend. On nous a dit ça en tout cas.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Meiosis]

Je ne trouve toujours pas l'explication...

Pourquoi les enzymes pour le stress froid sont moins efficaces puisqu'elles ont été obtenues par l'extraction depuis l'échantillon stress hydrique ? Donc ça devrait être pareil...

Ou bien j'ai mal compris la réponse de la prof et en fait les enzymes utilisées étaient bien celles de l'échantillon froid (le plus logique), en plus ces dernières ont été conservées congelées une semaine entre les deux séances de TP, ce qui pourrait expliquer ces résultats...

[invite4d04e446]

Je pense que l'explication numéro 2 est plus logique, une différence de congélation peut entrainer je pense une différence dans l'activité.

[Meiosis]

En fait je crois que j'ai trouvé le problème.

Lors de mon extraction il y a toutes les protéines, d'où le terme de protéines totales, et non seulement la bêta-glucuronidase.
Ainsi par exemple si j'extrais toutes les protéines de l'échantillon stress froid et stress hydrique et que via le dosage bradford j'ai plus d'absorbance avec le stress froid (ce qui est mon cas) ça ne veut pas dire qu'il y avait plus de bêta-glucuronidase dans l'échantillon stress froid, juste qu'il y avait plus de protéines.
Ensuite le fait de ramener tout à 15ug de protéines permet de comparer l'activité de la bêta-glucuronidase entre les deux stress, donc comparer l'activité du promoteur du gène de la bêta-glucuronidase.

S'il y a plus d'absorbance dans l'échantillon stress froid par rapport au stress hydrique et que j'ai plus d'activité enzymatique dans l'échantillon stress hydrique cela signifie sans doute qu'il y a plus de bêta-glucuronidase dans l'échantillon stress hydrique par rapport au stress froid mais moins de protéines diverses (= toutes les autres protéines) par rapport à l'échantillon stress froid, ce qui justifie cette absorbance inférieure malgré le fait qu'il y ait plus de bêta-glucuronidase dans l'échantillon stress hydrique. L'échantillon stress froid a donc beaucoup de protéines diverses mais peu de bêta-glucuronidase, ce qui fait quand même une absorbance supérieure à l'échantillon stress hydrique.

Au final je pense dire que le stress hydrique a permis une plus grande synthèse de bêta-glucuronidase et que donc la plante répond davantage au stress hydrique qu'au stress dû au froid in-vivo, peut-être parce qu'un stress hydrique est plus grave et nécessite une "intervention" plus rapide de la part de la plante ?

Le problème venait donc du fait que bradford détecte toutes les protéines et pas seulement la bêta-glucuronidase d'intérêt.

J'en suis presque certain. Au final le froid ne serait pas l'explication ou au moins pas la principale explication, puisque le but était bien de comparer l'activité des promoteurs et donc ça signifie obligatoirement qu'il n'y a pas la même quantité de bêta-glucuronidase synthétisée dans les deux échantillons.
En plus le froid ne permettrait pas d'interpréter entre le contrôle hydrique et stress hydrique, car là dans les deux cas il n'y a pas de froid et pourtant le contrôle hydrique montre une activité de la bêta-glucuronidase très réduite par rapport au stress hydrique, cela montre que cette différence vient obligatoirement d'une quantité inférieure de bêta-glucuronidase dans l'échantillon contrôle hydrique, donc d'une activité plus faible du promoteur du gène bêta-glucuronidase.

[invite4d04e446]

Je me suis renseigné sur le protocole Bradford, je suis d'accord avec ce que tu dis, il y a eu des interférences entre toutes les protéines.