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Absence amplification PCR, POURQUOI ?



  1. #1
    laperrot

    Absence amplification PCR, POURQUOI ?

    Bonjour,

    L'objectif de mon TP est de mettre en évidence des gènes candidats pour l'amélioration de la digestibilité du maïs fourragé. Pour cela, les analyses vont être réalisées sur Arabidopsis thaliana étant donné que son génome est séquencé. On sélectionne des parents mutés chacun pour un gène : soit CAD-C, soit CAD-D (inhibition de l'expression de ces gène par insertion d'un ADN-T dans la séquence du gène). On croise ces deux parents pour obtenir un individu double mutant (cad-c cad-d). Afin d'identifier approximativement l'insertion des ADN-T dans la séquence du double mutant, on utilise plusieurs couples d'amorce (l'amorce 5 est spécifique de l'ADN-T). On extrait donc l'ADN, on fait une PCR et une électrophorèse.

    Résultats :
    dans la séquence du parents muté cad-d : voici le positionnement des amorces (2D, 3D, 1 et 4).
    5'----AMORCE 2D--------AMORCE 3D------AMORCE 1--------xxxAMORCE5xxx--------AMORCE 4----3'

    D'après les résultats de la PCR et des recherches bioinfo, je sais que l'amorce 5 spécifique de l'ADN-T est localisée entre les amorces 1 et 4.
    Il y a une amplification du fragment entre :
    - les amorces 2D et 5
    - les amorces 3D et 5
    - AUCUNE amplification entre 1 et 5 -------------------------------> POURQUOI ???
    - AUCUNE amplification entre 5 et 4 (surement car la taille du fragment est supérieure à 1 kb et que la polymérase ne peut pas amplifier)

    Je n'arrive pas à comprendre pk il n'y a pas d'amplification entre les amorces 1 et 5, sachant que l'amorce 5 est inséré entre les amorces 1 et 4. Les résultats obtenus (PCR) provient de l'INRA, donc ils sont justes (ce n'est pas une erreur de manip).

    merci pour votre aide et les futures réponses apportées...

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    Dernière modification par laperrot ; 26/03/2015 à 19h57.

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