Clonage vecteur navette sur la levure

[invitee5da4315]

Bonsoir
Dans un exercice on me demande d’énumérer les étapes qu'il me reste à accomplir (après avoir amplifier ma séquence Insert) afin d'exprimer la protéine voulue dans une levure. Cependant, je bloque sur une étape.
-Digérer l'Insert et le vecteur par les enzymes de restriction .. ok
-Mélanger l'insert et le vecteur en présence d'ATP et ligase ... ok
-Utiliser le mélange de la ligation pour transformer des bactéries... là je ne comprends pas pourquoi passer par une bactérie !!!
-Cultiver les bactéries dans un milieu sélectif
-Purifier l'ADN plasmidique (miniprep) et vérifier après digestion qu'il s'agit bien du vecteur "Vecteur-Proteine"
-Utiliser le vecteur pour transformer les levures.

Pourquoi ne peut-on pas directement incorporer notre plasmide à la levure?
Merci
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[invite940778a2]

Bonsoir,

En fait, le passage en bactérie te sert à amplifier la quantité de plasmides, pour être certain que, lors de ta transformation, de l'ADN entrera effectivement dans la cellule.
Pour ne pas avoir à passer par les bactéries, il te faudrait amplifier ton gène - encadré de séquences homologues au génome de la levure - par PCR afin d'en avoir encore une fois un grand nombre. Les séquences homologues permettront un évènement de recombinaison et l'intégration de ton gène dans le génome. Dans le cas du plasmide, tu peux vouloir, ou non l'intégrer au génome ou bien le laisser autonome dans la cellule s'il dispose de sa propre origine de réplication.
C'est juste une question de quantité.

En espérant que cela réponde à ta question