qPCR

[meri99]

Bonsoir
voilà en gros mon expérience,
j'ai deux conditions un témoin et un stressé , par RT-PCR en temps réel , j'ai cherché à voir la différence d'expression entre ces deux conditions de la même variété,
je voudrai savoir à partir de quelle valeur peut-on dire que le rapport R (de fold change) est significatif
dans mon cas j'ai des valeurs de l'ordre de 1.2, 1.5, 1.7... est ce que je dois me suffire de dire que le stressé est exp 1.2 fois plus exprimé chez le stressé que chez le contrôle ?
d'autres personnes utilisent la méthode de l'expression relative ?
comment choisir entre les deux???

si vous avez des liens ou des articles dans ce contexte ?
je fais face à mes résultats toute seule , j'ai grand besoin d'aide
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[Loupsio]

Bonjour,
Non des changements sont plutot de l'ordre de "70", "200", "500"... mais si tu es toute seule comme tu le dis, es tu sur d'avoir les bons calculs? peut etre tout simplement que personne ne t'as dit comment interpreter les résultats, que tu y as été a l'instinct, et que pour le coup c'est un peu compliqué si personne ne t'as expliqué comment faire, avant

Explique nous tes calculs pour voir

[meri99]

bonjour
merci pour votre aide

Voici la règle que j’applique

Delta Delta Ct = ΔCt échantillon1 – ΔCt calibrateur (Delta Ct = Ct gène – Ct contrôle endogène )

RQ = Relative quantification = 2-ΔΔCt

j’ai trouver cette explication sur le net
« Nous considérons un résultat comme significatif lorsque le fold-change est de minimum deux, c’est-à-dire un RQ de plus de 2 ou moins de 0,5. Cet intervalle constitue la variation de la technique. C’est possible d’obtenir un RQ de 0.8 une journée et de 1.3 le lendemain. Si vous voulez observez un petit fold-change (1.5-2 fold), il vous faudra des échantillons parfaitement propres, probablement faire des quadruplicata, penser à utiliser 2 essais pour le même gène, et utiliser des contrôle positif avec des fold-change connus. » (L’article est en pièce jointe)
Voici mes résultats je vous un exemple pour une variété sachant que, Xt (contrôle), (Xs stressé) :


XS 18.68 18.679 -4.53076 0.83247 1.78
XS 18.68
XT 19.23 19.352 -3.69829
XT 19.48

Peut on alors dire que la différence n’est pas significative entre les 2 conditions stressé et contrôle selon le RQ

[meri99]

bonjour
merci pour votre aide

Voici la règle que j’applique

Delta Delta Ct = ΔCt échantillon1 – ΔCt calibrateur (Delta Ct = Ct gène – Ct contrôle endogène )

RQ = Relative quantification = 2-ΔΔCt

j’ai trouver cette explication sur le net
« Nous considérons un résultat comme significatif lorsque le fold-change est de minimum deux, c’est-à-dire un RQ de plus de 2 ou moins de 0,5. Cet intervalle constitue la variation de la technique. C’est possible d’obtenir un RQ de 0.8 une journée et de 1.3 le lendemain. Si vous voulez observez un petit fold-change (1.5-2 fold), il vous faudra des échantillons parfaitement propres, probablement faire des quadruplicata, penser à utiliser 2 essais pour le même gène, et utiliser des contrôle positif avec des fold-change connus. » (L’article est en pièce jointe)
Voici mes résultats je vous un exemple pour une variété sachant que, Xt (contrôle), (Xs stressé) :

var vleur moyenne delta Ct dlta delta Ct RQ
XS 18.68 18.679 -4.53076 0.83247 1.78
XS 18.68
XT 19.23 19.352 -3.69829
XT 19.48

Peut on alors dire que la différence n’est pas significative entre les 2 conditions stressé et contrôle selon le RQ

est ce que c'est juste??
je voudrai représenté ces résultats avec des diagrammes, j'imagine que ce sont les delta Ct qui faut prendre n'est ce pas?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Loupsio]

Déjà, premier truc, on utilise pas 2 dans la methode du , tu dois utiliser "1+ l'efficacité de tes amorces" (et déjà etre sur que tes amorces on une bonne efficacité qui est bien proche de "1"), ducoup "1+"efficacité" te donne quelque chose proche de 2, c'est pourquoi on parle de la methode des , mais il faut utiliser dans chaque calcul, l'efficacité que tu as calculé pour ton couple d'amorce, , si tu n'as pas calculé celles ci, il faut le faire car si l'efficacité est eloignée de 1 ce n'est pas bon et il te faut choisir d'autres amorces.

si on considere
G1 ton gene d'interet dans la condtion 1
et G2 ton gene d'interet dans la condition 2,
ainsi que ref1 ton gene de reference dans la condition1
et ref2 ton gene de reference dans la condition 2
et 1+E, ton efficacité réelle (proche de 2 mais pas forcement égale a 2)

alors:
Ng2/Ng1=
ducoup cette meme formule peut se simplifier si on suit les vieilles regles de mathématiques du lycée par :
(1+E)^{(Ct_G1)-(Ct_G2)}


tu fais pareil avec tes resulats de gene de reference,
apres ca tu as donc un Ng, ainsi qu'un Nref,

il ne te reste plus qu'a faire le rapport des deux (puisque que quand on parle du , il s'agit de deux rapports, tu viens de faire les premiers en faisant les rapports G2/G1 et Ref2/Ref1)

maintenant il faut faire le rapport des deux, ce qui revient a faire:

avec tes 1+E respectifs de chaque couple d'amorces

Et la tu as ton vrai R,
Maintenant, a voir si c'est ce que tu as fait car je n'ai pas testé tes valeurs

[meri99]

ehhh j'ai l'impression que ma méthode est plus simple , oui je compare à chaque fois avec une amorce de référence (actine )
je n'ai pas de doute dans mes calcules puisque je ne fais que suivre la méthode qu'on m'a donné sous format excel , je ne fais que remplacé
mais ce que je sais pas faire c'est l'interprétation des résultats ,
pouvez vous me confirmer pour mon exemple juste pour voir
si mon rapport est juste est ce que c'est la différence est non significative ?
et est ce que j'établie les graphes avec le delta Ct? pour montrer la différence (même si elle n'existe pas)
un grand merci d'avance

[Loupsio]

j'ai l'impression que ma méthode est plus simple

Je n'ai pas vérifié tes calculs, mais parfois quand c'est simple.... c'est qu'il y a un problème
Par exemple tu dis que tu as juste remplacé tes valeurs dans le tableau... et pour l'efficacité de tes amorces? tu ne la mentionne nulle part, tu l'as bien pris en compte? sinon déjà il y a déja un problème
Et je ne peux que t'encourager a ne pas suivre simplement une méthode qu'on t'as donné et remplacer des valeurs par d'autres sans savoir ce que tu fais en faisant ca, c'est la meilleur facon pour faire pleiiins d'erreur, non seulement sans le savoir, mais sans savoir ou elles sont, et sans savoir comment les corriger (par exemple tes valeurs d'efficacité, si tu ne les as pas...)
c'est vraiment la chose a proscrire en biologie

Au final bien qu'il y ait des calculs intermediaires qui peuvent impressionner, la méthode que je t'ai expliquée plus haut n'est pas compliquée, il faut juste savoir qu'au final ton calcul c'est :

le reste n'est que l'explication mathematique,

[meri99]

En fait je remplace dans le fichier parce que c’est plus simple que de calculer manuellement à chaque fois seulement
R= 2 –(19.352-23.05)-(-18.679-23.21) (exponentiel)
R=1.78
Je n’ai pas de doute avec mes résultats
Pouvez-vous me répondre sur le reste de mes questions svp
est ce que la différence est non significative ?
et est ce que j'établie les graphes avec le delta Ct? Pour montrer la différence (même si elle n'existe pas).
Pour l’efficacité des amorces, le logiciel renseigne déjà si il a présence de dimères par le melting curve, le faite aussi les valeurs des gènes de références soient stables est aussi un indicateur, sinon comment je dois faire
encore merci pour votre aide

[Loupsio]

En fait on utilise le meme calcul, comme quoi ma facon n'est pas plus compliquéé ^^ c'est juste que mathematiquement quand tu a une division genre 2³/2⁵ ca revient a
mais ducoup ta formule est la meme que la mienne,
et je ne peux que te répondre encore une fois.... : Tu dois calculer l'efficacité de tes primers sans ca tes résultats ne valent rien,
immagine que ton efficacité ne soit pas égale a "2" comme tu l'utilise dans ta formule mais que l'efficacité de ton gene en question est de 1.9 et lefficacité de tes primers control (actine) est de 2.1
SI tu as exactement la meme quantité de tes deux ARN (actine et gene d'interet) et que tu fais 35 cycles
tu te retrouveras pour l'actine avec 2.1³⁵ brins soit : 189528844864 brins si a l'origine tu n'en avais qu'un
et pour ton gene d'interet tu en aura 1.9³⁵ brins , soit : 5706581621
si tu regarde le rapport des deux tu as un rapport 33
Et tu peux donc t'ecrier Wahouuuu j'ai 33 fois plus d'expression du gène a que du gène b, alors que non a la base tu en avais une quantité strictement identique

Donc sans calculer ton efficacité des amorces tu induis un biais en pensant que l'un est 33 fois plus exprimé que l'autre (dans cet exemple) et toi tu arrives la avec des rapport de x2 x3, si rien qu'une erreur de calcul induit des differences aussi grandes alors comment savoir si ton x2 est vraiment x2 ou une erreur de calcul parce que tu n'as pas pris en compte l'efficacité réelle...

[meri99]

je vous remercie pleinement pour toute ces informations
je ne m'y connais pas très bien en qPCR, mais je sais que le rapport "R" me permet de dire (dans mon exemple) que mon gène d’intérêt est 1.78 X plus exprimé chez le contrôle que le stressé , (mais que cet expression ne parait pas être significative )
pour le calcule de l’efficacité des amorces , je ne sais comment faire , pourriez vous me donner la formule avec un exemple svp

[Loupsio]

je ne m'y connais pas très bien en qPCR, mais je sais que le rapport "R" me permet de dire (dans mon exemple) que mon gène d’intérêt est 1.78 X plus exprimé

Oui man nan justement il est là le probleme c'est que ton rapport n'est probablement pas de 1.78 en vrai, tu vois un truc de 1.78 car tu utilise une approximation, en vérité ton rapport est peut etre beaucoup plus petit ou beaucoup plus grand.

pour le calcule de l’efficacité des amorces , je ne sais comment faire , pourriez vous me donner la formule avec un exemple svp

AH bah c'est embêtant, :S je pensais que t'avais juste choisi de l'ignorer pour te faciliter la tache en utilisant une approximation, mais quelqu'un aurait du t'en parler, l'efficacité des amorces est quand même quelque chose d'essentiel pour une qPCR
Tu dois préparer plusieurs dilutions au dixième de ton echantillon, avec ca tu aura plusieurs courbes PCR qui sortirons le sunes apres les autres, et avec tout tes Ct tu obtiens une equation de droite, type y=ax+b, et a partir de l'equation de la drite tu obtiens ton efficacité

[meri99]

nous avons vérifié la qualité des amorces par PCR classique puis sur gel d'agarose la taille correspond et pas d'autre bandes , aussi les melting curve ne montrent pas de présence de dimères , mes amorces étaient bonne
si on considère que l'efficacité de mes amorces est de 100% , que peut on dire concernant le rapport, svp j'ai besoin de cette réponse, c'est important

[Loupsio]

nous avons vérifié la qualité des amorces par PCR classique puis sur gel d'agarose

Ceci ne te donne aucune indication sur l'efficacité des amorces qui est quelque chose d'important

la taille correspond et pas d'autre bandes ,

Ceci t'indiques que tes amorces sont spécifiques mais ca ne dit pas qu'elles ont une efficacité de 100%, nuance

aussi les melting curve ne montrent pas de présence de dimères ,

C'est une bonne chose qu'il n'y ait pas de dimérisation des amorces, mais encore une fois ca n'indique rien sur l'efficacité des amorces

mes amorces étaient bonne
si on considère que l'efficacité de mes amorces est de 100% ,

La tu vas un peu vite en conclusion, tes amorces sont bonnes ... Oui (ou plutot elles sont spécifique) mais ca ne veut pas dire qu'elles sont vraiment bonnes ni que leur efficacité est de 100%

L'efficacité c'est le coeficient multiplicateur que t'as a chaque cycle, en théorie il est de 2 puisque tu doubles ton nombre d'ADN a chaque cycles, mais en réalité il n'est pas de 2, disons que majoritairement, si tu prend des amorces potables pour une PCR classique, en grande majorité ca varie de 1.8 a 2.1 quelque chose comme ca approximativement, ce qui entraine une graaande difference lorsque tu fais du quantitatif, bien que en PCR classique tu t'en fiches un peu du moment que tu amplifie, donc que tes amorces soient spécifiques, c'est bien, mais ce n'est pas assez, il te faut vraiment l'efficacité, comme je te disais plus haut avec des amorces (spécifiques, bien bonnes et tout et tout) si l'une a une efficacité de 1.9 et l'autre de 2.1
si tu part d'une meme quantité d'ADN tu arrives avec 33 fois plus d'ADN pour celui dont les primers ont une efficacité de 2.1 ... 33 fois plus de l'un que de l'autre alors que tu avais autant d'ADN au départ, (et je le répète dans les deux cas ces primers sont spécifiques, ne forment pas de dimères, et sont excellent pour des PCR normales)

Tu ne peut vraiment pas te passer de calculer l'efficacité des amorces avant de faire du quantitatif, enfin je ne le concois pas, c'est comme faire une PCR classique et oublier de mettre le BET (ou autre colorant) dans le gel, et dire après "je ne vois rien c'est dans mon echantillon ya pas le gène en question"
Tu ne peux juste pas...

[meri99]

ben merci , mais le soucis pour moi est je ne pourrais pas le savoir puisque je ne suis plus dans ce labo j'ai été pour un très court stage et je suis sure qu'ils ont tout jeté maintenant, et donc la réponse à ma question je vais mettre dans mon rapport que la différence est non significatif, ce gène est donc down-regulated
merci à vous

[Loupsio]

la différence est non significatif, ce gène est donc down-regulated

En effet si c'est vraiment de 1 virgule quelque chose c'est non significatif, mais donc ce n'est pas "down-regulated", ca voudrait dire que dans ta condition testé ton gène est inhibé, or la il ne l'est pas, il est exprmé de la meme manière si le rapport est bien de 1.2

[meri99]

donc le gène est exprimé (up-regulated) mais la différence est non significatif , c'est donc en dessous de 1 qu'on peut dire que l'expression du gène est inhibé

[Loupsio]

mais non... il n' y a pas de differences en gros son taux d'expression ne change pas, ni inhibé ni surexprimé