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real time pcr



  1. #1
    XIII

    real time pcr


    ------

    salut
    je dois designer des oligos pour une real time pcr et j aurai beson d aide...
    deja est que quelqu'un connait un bon programme? j utilise primer 3 et il est plutot réticent pour em donner des amorces pres de l extremité 3' ( j en ai besoin etant donné que je fais une reverse transcriptase avant).
    et petite question bete : le primer peut se situer dans la région 3' utr ou est ce qu il y a des "contre indications"?
    Merci

    -----

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  3. #2
    piwi

    Re : real time pcr

    primer3 donne de bons oligos.
    Je ne vois pas pourquoi il ne te donne pas tes oligos en 3'.

    Pour lui forcer un peu la main tu peux exclure une région en 3' et ensuite le forcer à designer les oligos autour de cette région en lui indiquant que tu veux qu'il centre les possibilités autour de la région exclue.


    Voilou ma petite technique de sioux ^_^

  4. #3
    Annaick_R

    Re : real time pcr

    Salut,

    les régions 5' et 3' sont plus riches en A et T, donc le programme a du mal à trouver des oligos avec une Tm élevée. Allonge la taille de l'oligo, ça t'aidera peut-être à en trouver.
    La richesse en A et T fait aussi qu'il y a plus facilement des structures secondaires. Ca élimine aussi des possibilités.

    Il n'y a aucune contre-indication (c'est même conseillé) à placer des oligos en 3' UTR.
    Attention aux sites de poly adénylation multiples : tu risques de sous-estimer l'expression de ton gène.
    Ca m'est arrivé une fois, avec un couple d'oligo en 5' UTR j'avais 2 fois plus de copies qu'avec des amorces en 3' UTR! En fait, il y avait 2 types de transcrits, l'un avec une région 3' plus courte que l'autre et mes 2 oligos de la région 3' encadraient le site alternatif d'insertion de la queue poly-A.

    Si vraiment, tu ne trouve rien en 3', essaye en 5' si ton ADNc n'est pas trop long (< 2-3kb). En général, les RT sont efficaces jusqu'à 2-3kb.

    Courage, trouver les bons oligos c'est ce qu'il a de plus difficile en PCRq.

    Annaïck.

  5. #4
    XIII

    Re : real time pcr

    merci pour vos réponses!!!!
    donc maintenant j ai mes oligos (j espere que ca marchera)mais j ai un autre problème, j ai extrait mes ARN avec la methode du phénol chaud, est ce que ca pose des problemes pour une real time pcr? ou l etape de reverse transcription? si oui quel kit dois je utiliser pour purifier?
    merci d avance

  6. #5
    piwi

    Re : real time pcr

    chez nous on le fait au trizol. Ca marche tres bien.
    Je ne connais pas la technique du phenol chaud mais ca fait peur quand même

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    XIII

    Re : real time pcr

    bon ben je vais tenter alors....
    par contre il faut que je traite mes RNA a la DNAse ( je compte utiliser la roche dnase rnase free) et apres je purifie avec quoi?
    merci car tu m aides bcp!!!

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  10. #7
    gab

    Re : real time pcr

    c'est quoi comme bestiole que tu pratiques..?
    J'ai l'experience de Real T PCR sur:
    Trizol
    prep Guanidine "à la papa"
    Phenol chaud (sur vitis)

    Tout passe mais il faut que ta prep' soit irreprochable...
    C'est le secret d'un Q-pcr reussie... avec de bon primers... et ça c'est plutot aléatoire...
    J'ai commencé à dessiner des primers avec Vector NTi
    Mais le top c'est un logiciel fournit avec le light cycler de chez Roches (je n'ai pas de parts dans cette boite).
    Je sais pas ce que ce soft fait de mieux et qu'est qu'il peut prendre en compte de différent qu'un primer 3-like ...
    Voilà
    A+*

  11. #8
    XIII

    Re : real time pcr

    ben je bosse sur la levure et je fais l extraction au phénol chaud
    mais bon il faut traiter les arn a la dnase apres pour ne pas amplifier l adn génomique....
    mais pas besoin de purifier apres car on peut détruire la dnase facilement en chauffant (dixit roche).
    par contre je vais utiliser la machine de stratagene....

  12. #9
    Meningo

    Re : real time pcr

    Au passage, si tu obtiens des profils de PCR complètement bizarres et affreux en faisant comme tu dis, méfies-toi. Je faisais grosso-modo la même chose que toi et il s'averait que la concentration en sel de ma sauce n'était plus du tout adaptée pour la RT et la PCR. D'où précipitation nécessaire.
    C'est peut-être évident pour certains, mais après en avoir parlé avec des collègues, y'en a d'autres qui sont tombés dans le panneau.

    Dans ton cas, tu ne rencontreras peut-être pas le problème si tu utilises tous les réactifs du même fabricant (je pense...). Dans mon cas, je faisais les extractions avec Roche, Dnase Promega, RT et PCR Eurogentec sur la machine Applied

  13. #10
    piwi

    Re : real time pcr

    Juste par curiosité,
    pourquoi faire les extractions avec une méthode aussi compliquée (et toxique! le phénol chaud.... beurk......)

    Vous ne pouvez pas proceder avec le trizol? Plus simple (autant qu'une extraction d'ADN), pas de phase de digestion de l'ADN (le trizol le bouffe).... tout pour soit quoi!

  14. #11
    XIII

    Re : real time pcr

    bah je sais pas moi piwi....
    je suis en M1 et je reprends les techniques du labo lol

  15. #12
    XIII

    Re : real time pcr

    Par hasard personne n aurait de protocole de traitement a la Dnase en vue d'une RT PCR?
    merci

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  17. #13
    gorben

    Re : real time pcr

    Citation Envoyé par piwi
    pas de phase de digestion de l'ADN (le trizol le bouffe)
    Salut,

    J'espere que tu verifies bien ton absence d'ADN avant de passer en qPCR, d'experience, je peux t'assurer que le trizol ne bouffe pas tout l'ADN, loin de la...

    A+

  18. #14
    piwi

    Re : real time pcr

    Voui, je verifie toujours sur gel.
    Cela dit ca m'est arrivé une fois d'avoir un reste d'ADN mais c'est parce que je n'avais pas mis assez de trizol.

    Donc bon, si on met assez de trizol et que l'on laisse incuber assez longtemps on a pas de contamination. D'ailleurs, je me suis mal exprimé en disant "bouffer". Ca n'est pas une dégradation de l'ADN mais simplement une séparation dans les phases. On a même reussit à faire des PCR à partir d'extraction trizol (m'enfin c'est lourdingue à faire)

    En conclusion j'ai jamais eu vraiment de problème de ce coté là.

  19. #15
    Annaick_R

    Re : real time pcr

    J'utilise le kit RNeasy de Qiagen (colones) en faisant le traitement à la DNAse (Qiagen) directement sur la colonne pendant l'étape de lavage des ARN. Comme ça la DNase est eliminée au lavage. Après l'élution tu as des ARN tous propres, sans DNase (problématique pour l'étape de PCR suivante !) et sans ADN génomique qui te donnerait des résultats faussement positifs et sur-estimés.

    A mon avis, la vérification sur gel permet de visualiser une grosse contamination par de l'ADN génomique, mais s'il en reste quelques ng, ça ne se verra pas. Je préfère contrôler l'absence de contamination par de l'ADN génomique en faisant une PCR avec des oligos spécifiques d'un intron.

    Annaïck.

  20. #16
    piwi

    Re : real time pcr

    En même temps, si tu as du genomique, tu devrais le voir avec tes genes de controle.

  21. #17
    Annaick_R

    Re : real time pcr

    Citation Envoyé par piwi
    En même temps, si tu as du genomique, tu devrais le voir avec tes genes de controle.
    ça dépend du niveau d'expression de tes gènes de contrôle et de ton gène cible...

    Si tes gènes constitutifs ont un niveau d'expression de l'ordre de 10 000 copies/ng ARN et que ton gène cible est à 500 copies/ng ARN, l'impact d'une faible contamination d'ADNg ne sera pas le même.

    Ca ne posera aucun problème sur la mesure de l'expression d'un gène fortement exprimé mais elle aura beaucoup plus d'influence sur un gène faiblement exprimé.

  22. #18
    piwi

    Re : real time pcr

    si le gene est fortement exprimé on ne le voit pas.
    Si le gène est faiblement exprimé on le voit. D'où le fait de prendre un gène de controle faiblement exprimé et fortement induit (ou le contraire). Si y a un Couak, ca saute aux yeux.
    Je ne vais pas vous dire sur quoi je travaille mais je peux vous assurer que ca me sauterait aux yeux ^_^

    Bon, maintenant j'ai refais des RTqPCRs hier et j'avais oublié un truc. Dans le kit qiagen que j'utilise pour mes RTs il y a une phase dite "G-wipe" qui dégrade l'ADN génomique. Comme ca, la question est réglée, je fais comme vous (seulement avec ces merveilleux kit maudits de chez qiagen , on ne sait même plus ce que l'on fait tellement c'est simple.)

  23. Publicité
  24. #19
    XIII

    Re : real time pcr

    Une autre petite question....
    est ce que ca pose un probleme si mon gene de controle interne est beaucoup plus exprimé que mon gene d' interet? ( ADNr par rapport a un poly A)
    Il faudra donc que je dilue la solution dans laquelle je veux mesurer le controle par rapport a celle du gene d interet; ca ne pose pas de probleme?
    merci

  25. #20
    Annaick_R

    Re : real time pcr

    Si ça pose un gros problème (cf les 3 posts précedents).

    Je te conseille de choisir plutôt un gène d'expression constitutive, par exemple le facteur d'élongation eIF4-A ( j'ai la séquence des oligos chez Arabidopsis thaliana si ça t'intéresse).

  26. #21
    Annaick_R

    Re : real time pcr

    (suite du post précedent)
    En plus, les ARN ribosomiques ne sont pas transcrits par la même polymérase que les ARNm... L'abondance des ARN ribosomiques ne reflète donc pas toujours l'état physiologique de la transcription des ARNm.

    Annaïck.

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