Real Time -RT-PCR

[invitef816fdcb]

Bonjour tout le monde,



Je vais devoir faire des qRT-PCR (PCR quantitative) mais j'avoue que je n'y connais pas grand chose!. Quelqu'un pourrait m'expliquer un peu la méthodologie ou les procdures à suivre dans un ordre expérimental, par exemple dans le meme ordre que cette technique doit etre faite ? Puis qu'elle est la taille minimale-maximale des sequences à amplifier par cette méthode ? est ce que des sequences de 200-350 pb sont amplifiables par le qRT PCR?

Je serais très reconnaissant pour toute réponse.
Très bonne journée à tous
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[piwi]

Salut,

pour la taille des fragements à amplifier c'est entre 100 et 300 pb.
Avant de te lancer il faut que tu saches que tu vas devoir faire des cycles courts et qu'il en faudra en pratique entre 35 et 40 pour arriver au plateau de la PCR.
Comme il y a beaucoup de cycles il faut que tu fasses attention à definir des conditions dans lesquelles la spécificité de ton amplification est maximale, faute de quoi des bandes parasites vont perturber ta quantification.

Donc d'un point de vue methodologique rien de particulier dans l'extraction des ARNs (trizol) et dans la reverse transcription.
Ensuite il faut que tu definisses deux trois paires d'oligos dans la region 3' de tes RNAs cibles (le site primer3 est pas mal) et que tu testes les couples pour voir celui qui va le mieux sur une machine PCR classique. Tu optimises les conditions et hop! c'est parti!


moi là j'utilise un programme du type:
95° 1 min

40 cycles
95°1 sec
60° 15sec
72° 15 sec

72° 30sec
4°...

Note,
pour les RTqPCR on pool souvent plusieurs echantillons pour minimiser les variations individuelles (au moins 3 echantillon par pool mais 5 c'est mieux) et on teste 3 pool (5 c'est mieux)

Bon courage ^_^
(moi aussi j'ai la tête dedans en ce moment)

[gorben]

Salut
Trés important, tes oligos ne doivent absolument pas faire de dimere ni avoir de structure secondaire sinon tu vas galerer. Quelque soit la methode de detection que tu utilises fais quand meme quelques essais au sybrgreen pour voir si tu fais des dimeres de primer (courbe de fusion).
Avant de faire ta RT, verifie par une PCR qui marche bien que tu n'as plus du tout de contamination ADN (une PCR de 45 ou 50 cycles par ex).
Choisis bien ton gene de menage des le debut, mieux vaut passer un peu plus de temps a faire de la biblio et a choisir un bon gene de menage plutot que de devoir refaire les mises au point en cours de route. Ton gene de menage doit avoir une expression pas trop differente de celui que tu cherches à quantifier (par exemple, l'ARNr n'est pas genial pour les genes trés faiblement exprimé...)

Ensuite ben... bon courage, je trouve la mise au point un peu chiante!!

a+

[invitef816fdcb]

Merci à tous deux.

En ce qui concerne le gène de ménage (gène constitutif) j'ai choisi l'actin (beta-actin).
combien d'ARN et d'ADNc utilisez-vous dans vos reactions ?


Merci encore une fois

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

+je dilue mes ARNs à 1 gamma et j'en utilise 5 micro litre dans la RT que je reprends au final dans 200

j'utilise 1 micro litre de ca dans ma pcr (volume final 15 micro litre)

[gorben]

je prends 500ng d'ARN pour ma RT (20µl) je reprend le tout dans 100µl et j'utilise 5µl pour ma PCR.
Chose importante à preciser, je bosse sur des bacteries...