Bonjour, je suis etudiante en 3e annee de biochimie (desolee pour les accents j'ai un clavier qwerty)
J'ai un rapport a rendre jeudi, et je n'ai rien compris des tps! Pas rien mais une grande partie! Je vous explique.
Donc en fait dans le 1er on a transforme des bacteries E.Coli en leur inserant un plasmide pBR322. On obtient donc des bacteries competentes resistantes a l'ampiciline.
Ensuite au TP2 on a effectue un clonage moleculaire. Alors au depart on avait un vecteur compose de pBluescript digere par EcoRI et un melange avec pBluescript digere par ECORI pBR(eco4)(compose de pBR322 et 4 segments d'ADN de 300pb clones au site de restricition) digere aussi par ECORI.
On a purifie le vecteur et le melange pour eliminer les enzymes de restriction et ensuite on a effectue 3 depots sur un gel d'agarose: le vecteur, le melange sans ligase et le melange avec la ligase T4. Deja a cette etape je ne comprends pas tres bien le but de cette electro et ce qu'on devrait avoir
Ensuite on a integre le melange avec ligase et sans ligase dans les bacteries competentes preparees prealablement. on les met en culture sur X-gal et ampiciline. On observe des colonnies blanches et bleues donc en fait ca c'est pas rapport a l'insert, si il vient s'inserer au niveau du lacZ la B-gal nest pas fonctionnelle et du coup on a des colonnies blanches, au cas contraire elles sont blanches.
Y a un truk qui me perturbe c'est que pour le sans ligase les colonnies blanches et bleues qu'est ce qu'elles ont insere exactement? etant donne qu'on na pas de plasmides car on na pas rajoute de la ligase au melange. C'est pas par rapport a l'insert du coup? je peux pas dire que les colonnies blanches n'ont pas le fragment pBluescript?
Apres on procede a l'extraction des plasmides en prenant 1 culture bleu et 3 cultures blanches on digere les plasmides extres avec HindIII puis fait une electro et la aussi je comprends pas le principe de cette electro et comment interprete les resultats qu'on obtient!
Please jai vraiment besoin d'aide, je trouve pas de reponses et j'ai pas envie de me taper un 0!!!!!!!