Analyse plasmides recombinants/non recombinants

[AnnaD96]

Bonsoir à tous !

Voilà, je suis étudiante en biologie et dans le cadre d'un TP, je dois déterminer si j'ai bien affaire à des plasmides recombinants.

Alors voilà. On a le plasmide pBSK qui fait 3 kb. Le technicien de laboratoire a dans un premier temps clivé ce plasmide grâce à une enzyme de restriction (EcoRI) au niveau d'un site multiple de clonage situé au niveau de l'opérons lactose puis l'a transféré dans une bactérie d'E.coli. Ensuite il a fait une sélection blanc/bleu pour distinguer les bactéries contenant les plasmides recombinants des non recombinants. Ensuite, on nous a donné à nous, les étudiants, deux souches A et B. On nous a demandé de lyse les bactéries, puis après plusieurs étapes de purification on a obtenu les plasmides seuls. Ensuite, avec différents échantillons, on a fait pour A et B, une PCR, une digestion par EcoRI puis on a fait migrer ces deux produits dans un gel dagarose 1% avec l'ADN A et B non digéré. Au final on a 10 puits :

1 : Marqueur de poids moléculaire
2 : plasmide A non digéré
3: plasmide B non digéré
4 : Marqueur de poids moléculaire
5 : ADN A PCR
6 : ADN B PCR
7 : Témoins PCR (rien d'observable, pour montrer que c'est bien l'ADN qu'on observe dans les autres puits)
8 : ADN A digéré
9 : ADN B digéré
10 Marqueur de poids moléculaire.

Pour les puits 2 et 3 j'observe plusieurs bandes mais je l'ai justifié en disant que le plasmide était sous plusieurs formes (relâché, superenroulé…)
Pour le puits 5, je n'observe rien, mais c'est du a une erreur de manipulation.
Et mon problème vient de l'interprétation du puits 6…
En fait, j'ai une bande à 3000 pb, et une bande à 6000… sachant que mon plasmide fais 3000 pb est ce que ça veut dire que mon insert fait 3000 pb et qu'il y a des plasmides non recombinants (bande à 3000 pb) ? ou y a t-il encore une histoire de relâchement ? Je me suis aussi demandé s'il était possible qu'il y ait des inserts en large excès et que les plasmides soient tous recombinants.. lors de la lyse de mes bactéries, un grand nombre étaient bleues dans mon tube A contrairement à mon tube B ou elles étaient toutes visiblement blanches… De plus, la bande à 3000 est beaucoup plus prononcée que la bande à 6000, à peine visible…
Si quelqu'un peut m'aider à comprendre
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[Yoyo]

Salut

C'est difficile de répondre comme ca... car ca va beaucoup dépendre de la migration. Est-ce qu'il te serait possible de mettre une photo du gel ici?

YOyo

[AnnaD96]

Bonjour

voilà la photo du gel

[Yoyo]

Merci c'est beaucoup mieux avec une image

Ce qui est sur c'est que la digestion du puit 9 a mal fonctionné car tu as presque le meme profil que dans le puit 3.
Concernant ta question du puit 6, je serait presque pret à parier que ce que tu vois est ton plasmide B (donc ta matrice) mise en trop grande quantité. Ca ressemble à du plasmide et comme ni ta pcr dans le puit 5 (tu as parlé d'une erreur de manipulation) ni dans le puit 7 (pourquoi?) n'ont fonctionné, je serait tenté de dire qu'aucune de tes PCR n'a marché malheureusement.
Tu pourrais nous dire quelle quantité de plasmide tu as utilisé et quelle erreur a té faite dans le puit 5?

Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[AnnaD96]

Merci pour ta réponse

Le probleme c'est que pour le puits 6 je ne sais pas quoi déduire... Pourquoi y a t il 2 bandes ? La bande a 3000 correspondrait à un excès de plasmides non recombinants et la bande a 6000 mon plasmide contenant l'insert ? Le soucis c'est que quand j'ai lysé les bactéries, je n'en n'ai vu aucune de bleue dans le culot contrairement à l'échantillon A... Or d'après ce que j'ai compris, si les bactéries sont bleues, cela signifie que LAC Z est toujours fonctionnel et donc que l'insert n'est pas present... :/

Ensuite pour le puits 7, c'est normal, c'est un témoins ou l'ADN n'a pas été ajouté. Concernant le puits 5, je ne sais pas trop, étant donné que nous ne devions ajouter qu'un microlitre d'ADN à notre préparation, je pense que j'ai du commettre une erreur à ce moment là..

[Yoyo]

OK, et tu as déposé quelle quantité de plasmide dans ton puit 3 pour avoir une comparaison.
Je pense que les deux bandes de ton puits 6 peuvent être le plasmide linéaire, et la version superenroulée.
Mais ca voudrait dit que tu en as mis beaucoup trop dans ta PCR!

YOyo

[AnnaD96]

pour le puits 3, on a mis 5uL de colorant et 10uL d'ADN non digéré. Pour la PCR on a mis 12,5 uL de "master mix", 1uL d'amorce M13F, 1uL d'amorce M13R, on a complété avec de l'eau jusqu'à 24uL puis on a mis 1uL d'ADN plasmidique