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Exercices séparation et purification d'une protéine



  1. #1
    abcd64

    Question Exercices séparation et purification d'une protéine


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    Bonjour, je rencontre de gros soucis en révisant des exercices de biochimie sur les méthodes de séparation et purification de protéines. Voici les 3 exercices pour lesquels j'ai du mal et mes raisonnements...

    Exercice 1
    exo 1.jpg
    Le SDS PAGE est une électrophorèse en condition dénaturante donc elle permet de séparer seulement suivant la taille.
    L'IEF sépare selon le pI.
    D'après ce que je comprends, la fraction éluée (de la chromato d'hydrophobicité précédente) contient encore 3 protéines et la protéine d'intérêt qu'on veut isoler est celle qui a la bande la plus large (?). Pour purifier cette enzyme, je proposerais alors de faire une chromatographie échangeuse d'anions avec le tampon MES (pKa=6.1) pour commencer (donc la protéine serait chargée négativement puisque pI=4.7 et serait donc retenue sur la colonne) et ensuite j'abaisserais le pH progressivement avec le tampon malate (pKa=3.4) comme ça la protéine se chargerait positivement et serait donc éluée... Sauf qu'il y a une protéine de pI très proche de celle d'intérêt, mais également une protéine ayant un poids moléculaire très proche de l'enzyme... donc j'ai quelques doutes...

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    Exercice 2
    exo2 1.jpgexo2 2.jpg
    Et bien là, à vrai dire... je sèche complètement.. est-ce que vous avez quelques pistes pour m'éclairer svp ?
    Je sais juste que le protéine AsdF a été synthétisée avec une étiquette His donc elle va être fixée sur la colonne d'affinité (à l'atome de Nickel) et ensuite on élue avec l'imidazole qui va prendre la place de l'His Tag donc la protéine va se détacher... Mais je ne comprends pas pourquoi on a 3 bandes sur le gel SDS Page... car théoriquement on ne devrait avoir qu'une seule bande qui correspond à la protéine AsdF puisque c'est la seule ayant l'étiquette His.

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    Exercice 3
    exo 3.jpg
    D'après la figure a, on sait donc que le complexe est formé des protéines PapD et PapG car les anticorps anti-PapG et anti-PapD réagissent au niveau du complexe. Ce complexe a un pI différent des pI de PapD et PapG.
    D'après la figure b, on a 2 bandes sur le gel SDS-Page qui correspondraient donc à chaque protéine. Comme c'est une électrophorèse en conditions dénaturantes, les 2 protéines seraient donc liées par des interactions faibles dans le complexe (donc liaisons H, interactions électrostatiques, hydrophobes, forces de Van der Waals...), et non des liaisons covalentes. Concernant la stoechiométrie je dirais qu'il y a dans le complexe autant de protéines PapD que de protéines PapG dans le cas où PapD (pI = 9.4) est la bande de poids moléculaire plus élevée et PapG (pI = 5.1) est la bande de poids moléculaire plus faible sur le gel SDS-Page...
    Mais là encore, je ne suis pas du tout sûr de mes réponses !


    Merci à tous ceux qui prendront le temps de s'intéresser à ces exercices et désolé pour la longueur du message...

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  3. #2
    Tibosax

    Re : Exercices séparation et purification d'une protéine

    Exercice 1 : Le truc c'est qu'on ne sait pas si la fine bande la plus proche de la protéine d'intérêt (ouai je pense qu'il s'agit en effet de la bande la plus large) est la même dans les deux cas. Je soupçonne que non, car sinon, j'ai, comme toi, un peu de mal à savoir comment je séparerais les deux. Mais effectivement, ta chromatographie échangeuse d'ions convient, et si mes soupçons sont avérés, une size exclusion devrait permettre d'éliminer l'autre protéine. Dans le cas contraire...

    Exercice 2 : Encore une fois, drôle de résultat. On dirait que la protéine AsdF (d'ailleurs c'est quoi cette prot ? Je ne trouve rien, ni sur google, ni sur UniProt) interagit avec des protéines de ta bactérie (j'imagine qu'on est chez E. Coli), ou bien des protéines très chargées négativement de ta bactérie interagissent avec les billes. Mais bon, ici, la solution est plutôt facile. Quelles qu'en soit les raisons, un petit coup de spectrométrie de masse permettra d'identifier les protéines.

    Exercice 3 : Tu as tout bon. La différence de comportement entre gel dénaturant et non dénaturant renseigne sur une interaction (d'ailleurs, qu'est-ce que ça veut dire type d'interaction ? Soit c'est covalent - et donc c'est pas une interaction - soit c'est non covalent et c'est une interaction). Et l'intensité des bandes sur le gel dénaturant renseignent sur la stœchiométrie (1:1 ici).

    Bon, j'ai pas l'impression d'avoir servi à grand chose. Si ça peut te rassurer, tu as compris ton cours, c'est juste que ces exercices sont un peu bizarres (surtout le premier en fait).

  4. #3
    abcd64

    Re : Exercices séparation et purification d'une protéine

    Bonjour Tibosax, merci pour ta réponse (qui me sert je t'assure!!)

    Pour l'exercice 1, ok j'ai compris. Et oui dans le cas contraire, ça va être difficile de séparer les 2 protéines...

    Pour l'exercice 2, ok aussi (pour la protéine je ne sais pas du tout... les exercices sont des annales d'examen de notre professeur, qu'on avait également au premier semestre et les énoncés ne sont jamais clairs). Et donc pour la spectro de masse en fait, est-ce que le principe c'est bien ça ? -> on fragmente la protéine, donc on a plein de fragments où on aura du coup un fragment avec le premier acide aminé, un autre avec les 2 premiers, un autre avec les 3 premiers... et ensuite on compare avec la masse moléculaire théorique des différents acides aminés et on remonte à la séquence en acides aminés ?

    Et pour l'exercice 3, est-ce que l'intensité des bandes en SDS-PAGE renseigne forcément sur la stoechiométrie dans le complexe ? ou il y a des cas particuliers où ce n'est pas valable ?

    En tout cas merci pour ta réponse rapide, ça m'éclaire un peu (même beaucoup) !

  5. #4
    Tibosax

    Re : Exercices séparation et purification d'une protéine

    Citation Envoyé par abcd64 Voir le message
    on fragmente la protéine, donc on a plein de fragments où on aura du coup un fragment avec le premier acide aminé, un autre avec les 2 premiers, un autre avec les 3 premiers... et ensuite on compare avec la masse moléculaire théorique des différents acides aminés et on remonte à la séquence en acides aminés ?
    Pas exactement. On digère les protéines à la trypsine avant de mesurer leur masse moléculaire. Cette enzyme coupe très précisément en C-ter des lysines et arginines, sauf si celles ci sont suivies d'une proline. La masse moléculaire de chaque fragment est ensuite mesurée et on peut remonter au contenu en acide aminé. Ça peut sembler trivial pour de petits fragments, mais pour de longs fragments (ça arrive que le contenu en lysine et arginine de la protéine soit faible), il est parfois difficile de remonter à 100% au contenu en acide aminé. Chaque protéine ayant un pattern de digestion bien particulier, on réalise une digestion in silico de la banque de donnée, puis on regarde si les fragments de la protéine collent à certains fragments de la base de donnée.

    Ensuite, plusieurs solutions. La plus simple, on a affaire à une seule protéine, qui donne un set de fragments. Certains matchent uniquement à une protéine en question, d'autres à de multiples protéines. On regarde si tous les fragments matchent au moins sur la même protéine, puis on regarde si tous les fragments théoriques de la-dite protéine - digérée in silico - sont bien retrouvés dans l'échantillon. Enfin, on peut vérifier que tous les fragments sont représentés en d'égales proportions.

    Voilà, ça c'est le cas simple qui n'existe pas. La réalité est plus complexe, car on digère souvent un mix de plusieurs protéines dont chaque fragment peut lui même matcher à divers protéines. De tas d'outils statistiques prenant en compte les corrélations entre évènement de matching permet de donner une liste de protéine auxquelles un score et une abondance sont attribués, le score reflétant alors le caractère "certain" de l'analyse.

    Enfin, on peut également réaliser des digestions partielles. On verra apparaitre des fragments doubles, triples, etc qui contiennent des liaisons Lys-Xaa ou Arg-Xaa ayant échappé à la digestion (d'où le nom digestion partielle). Ces fragments apportent une information supplémentaire, mais aussi plus complexe à appréhender : est-ce que le fragment que je viens de voir est un fragment simple (auquel cas je suppose qu'il ne contient pas de liaison Lys-Xaa ou Arg-Xaa), ou s'agit-il d'un fragment "multiple" ?

    Bon, je me relis, et j'ai pas l'impression d'avoir été très clair. Faut dire que je n'ai jamais eu que 2 heures de cours sur la masse spec dans ma vie, et que les expériences de mass spec que j'ai fait ont été réalisées par une équipe d'ingénieurs spécialisés. Un vrai cours de mass spec sera sans doute plus clair?

    Citation Envoyé par abcd64 Voir le message
    Et pour l'exercice 3, est-ce que l'intensité des bandes en SDS-PAGE renseigne forcément sur la stoechiométrie dans le complexe ?
    Excellente question. Et tu vas me détester, mais la réponse est non. Ça n'est même jamais le cas ! Mais ça personne n'y pense jamais, aussi ne t'embête pas trop, tu en viendrais à critiquer tous les exercices qu'on te présente...

    Je m'explique. D'ailleurs, tout ce qui va suivre peut être adapté aux gels d'ADN en présence de BET.

    Le Coomassie, utilisé pour les gels de protéines SDS-PAGE, interagit - supposément (d'après Wikipedia) - avec les acides aminés basiques et aromatiques. Autrement dit, chaque protéine fixe différemment le Coomassie de par son contenu en acide aminés! A intensité égale, on peut - comme tout le monde le fait - supposer avoir deux protéine en quantité égale, mais aussi supposer avoir deux quantités différentes de deux protéines qui fixent différement le Coomassie. Ça, c'est l'aspect que tout le monde connait mais que tout le monde choisi de négliger sciemment parce que "toutes les protéines ont plus ou moins la même richesse en acides aminés" (tout est dans le "plus ou moins").

    L'autre aspect, que personne ne réalise, c'est qu'à richesse identique (%aa), une protéine plus grande fixe plus de Coomassie qu'une petite protéine. Autrement dit, à intensité égale sur le gel, la quantité de matière - et donc la masse - en acides aminés est la même, mais la quantité de matière en protéine, elle, est différente ! Deux protéines de taille relative 2:1 (une est deux fois plus grande que l'autre) caractérisées par une intensité de marquage au Coomassie identique, ont en fait un rapport de quantité de matière de 1:2 (la petite est deux fois plus concentrée que la grande). Deux fois plus de protéine - en quantité de matière - d'une protéine deux fois plus petite, ça nous fait bien une masse de protéine, donc d'acides aminés, donc de Coomassie identique.

    Retournons à ton exercice. Déjà, est-ce que les deux protéines ont le même contenu en acide aminés ? Non, et ça tout le monde le néglige - à tort ou à raison. D'autre part, est-ce que tes protéines font la même taille ? Absolument pas. Si on veut calculer la stoechimétrie, il faut diviser l'intensité des bandes par la taille des protéines. Dans ton cas, si on choisit de définir l'intensité des bandes par la valeur X, et si on part sur des tailles de protéines de 35kDa (A) et 28kDa (B), alors les pourcentages de A et de B dans le complexe sont :

    %A=(X/35)/(X/35 + X/28)
    %B=(X/28)/(X/35 + X/28)
    d'où une stœchiométrie de %A/%B=(X/35)/(X/28)=28/35

    Comme je l'ai dit plusieurs fois, personne ne se rend compte de ça, j'ai vu des publications avec des quantifications sur gel complètement fausses. Du coup quant à savoir quelle est la bonne réponse, il faut se demander si le correcteur est intelligent ou pas. Et je pencherais plutôt pour la deuxième solution personnellement...
    Dernière modification par Tibosax ; 26/04/2016 à 20h57.

  6. A voir en vidéo sur Futura

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