Méga-amorce avantage, inconvéniant

[invite308fe65d]

Bonjour à tous, à quelques jours de mes partiels, j'éprouve des difficultés majeurs sur les annales des partiels des années précédentes. En effet le sujet porte sur la méga-amorce que nous avons vu uniquement en Travaux-Pratique et nous n'avons donc aucun cours dessus. Et je ne trouve que des réponses contradictoire ou que je ne comprends malheureusement pas.

Mes questions sont donc les suivantes "Quels sont les avantages, défauts et limites de la technique de la méga-amorce ?"

"Que pouvez-vous proposer comme manipulation simple pour répondre à la limite majeure de cette technique ?"

"Que décidez-vous de vérifier avant l'expression de la protéine mutée ? Pourquoi ? "

Je vous mets le sujet complet en pièce jointe et je remercie par avance ceux qui pourront m'aider dans mes révisions et ma compréhension de la biologie moléculaire en général. Bonne soirée BM0501.pdf
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[invite2eb5a45f]

Ce serait bien que tu fasses un schéma de la technique, parce que des techniques de mutagénèse par PCR, il y en a plein. Ah oui et on aurait bien aimé apprendre que tu parlais de mutagénèse dans ton message plutôt que de le découvrir dans le pdf...

Est-ce qu'il s'agit de cette technique ? http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/res...cr/mutapcr.htm

[invite308fe65d]

C'est vrai que j'ai oublié de préciser que c'était de la mutagenèse et j'en suis totalement désolé. voici un schéma, la technique de la méga-amorce consiste si j'ai bien compris à faire 2 PCR successive. La premier produit après avoir été purifié est utilisé comme amorce pour la seconde PCR. J'ai aucun problème pour ce qui est de dessiner des amorces, de trouver les sites de restriction les plus adéquates mais je ne vois pas ce qu'apporte en plus la méthode et quelles peuvent être les inconvénients (peut être le coût ? Je sais que commander des amorces à un coût élevé ). Et surtout la limite ? Une limite de taille ? De copie possible ? Je n'en sais pas plus et ça me pose problème. Voilà tout

[invite0f74952d]

Bonjour, voici quelques pistes de réponses :

Les limites de la technique correspondent à la taille de la méga amorce (au-delà de 400 pb le rendement est trop faible).
Défauts : rendement très faible implique que le fragment PCR doit être cloné à la fin de la manipulation, et enfin si la Tas polymerase utilisée ne comporte pas d'activité de correction d'erreur, peut induire des mutations.
Avantages : si le fragment PCR obtenu à l'issue de la 2ème PCR est à la bonne taille, alors on est sûrs à 100% qu'il y a mutation.

Pour répondre à la limite majeure de cette technique, une 3ème PCR peut être réalisée uniquement avec les amorces de clonage (PCR classique) afin d'amplifier le gène sauvage, et donc obtenir un rendement plus important.

Enfin, avant de procéder à l'expression de la protéine, on peut vérifier l'intégrité de la séquence en dehors de la base que l'on a muté, afin de vérifier que la Taq polymerase n'a pas ajouté de mutations non désirables.

J'espère que ces réponses pourront t'aider Bon courage

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite308fe65d]

Wahou merci c'est exactement ce dont j'avais besoin ! Merci beaucoup !