PCR et mauvaise amorce

[invited20cd97b]

Bonjour,
Je suis un etudiant de master en stage dans un labo de zoologie a Cambridge. Globalement l'objectif de mon stage est le sequencage d'un gene chez une espece de singe afin de voir si le gene est fonctionel. Voila pour le context general, maintenant le probleme:

Ca fait une semaine que je galere avec ma PCR. Elle ne donne vraiment rien... j'ait essaye de changer les quantitees dans mon mix PCR, de changer mes cycles, mais en vain...
Apres cette semaine d'errance, j'ai enfin trouve d'ou pouvait venir le probleme... Un des primer comporte une erreure... Mon maitre de stage a fait une faute de frappe en tappant la commande et du coup j'ai un G en trop en plein milieux de mon amorce.

Donc voici ma question: cette base est elle a la base (Mouhaha) de mes erreurs de PCR?
Je sais bien que du coup l'amorce et l'ADN ne sont plus complementaires, mais je me demandait si la fin de la sequence, qui est, elle, complementaire, ne pouvait pas suffire.

Autre question... Mon autre amorce etant tout a fait bonne, est il normale que je ne vois rien sur mon gel?
J'aurais pense voir un smir dans la mesure ou la sequence aurait du etre amplifier dans un sens et s'arreter un peut n'importe ou

Je tiens a preciser que je vien d'un master d'ecologie, et que donc ca fait un certain temps que j'ai pas fait de biologie moleculaire, donc je tien a m'excuser pour ma novicitude en matiere de PCR.



Merci d'avance pour vos reponces, et desole pour les fautes de frappe, je commence seulement a m'habituer au clavier qwerty.

Force et honneur
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[inviteabac6f11]

Bonjour Le-Vaillant,
Tu touches à peine du bout du doigt les problèmes de la PCR. 2 secondes de 3615 MyLife : ma boss a passé 4 mois sur une PCR qui ne marchait pas, j'arrive et après une semaine, sans rien changer, j'obtiens des bandes sur mon gel...

Je dirai que oui, cette base pourrait être à la base de ton problème. Les amorces font partie des points critiques de la PCR. J'ajouterai (mais cela est sujet à vérification) que du fait que cette base se trouve au milieu, la zone couverte par l'amorce n'est pas suffisante pour la polymérase. Peut-être que si elle avait été à la fin... Et encore, je ne parierai pas là-dessus.

Pour ce qui est du smire que tu attendais... N'y a-t-il pas un problème dans les Tm ? Vu que ton amorce est fausse... En tout cas, moi je n'ai jamais vu de smire dans les cas où mon amorce n'était pas bonne.

Bon courage, j'espère que d'autres étayeront ma réponse, je ne te sers pas à grand chose là.

[invite44594c28]

Peut être essayer avec une autre polymérase?

[Flyingbike]

Bonjour Le-Vaillant,
Tu touches à peine du bout du doigt les problèmes de la PCR. 2 secondes de 3615 MyLife : ma boss a passé 4 mois sur une PCR qui ne marchait pas, j'arrive et après une semaine, sans rien changer, j'obtiens des bandes sur mon gel...

Je dirai que oui, cette base pourrait être à la base de ton problème. Les amorces font partie des points critiques de la PCR. J'ajouterai (mais cela est sujet à vérification) que du fait que cette base se trouve au milieu, la zone couverte par l'amorce n'est pas suffisante pour la polymérase. Peut-être que si elle avait été à la fin... Et encore, je ne parierai pas là-dessus.

Pour ce qui est du smire que tu attendais... N'y a-t-il pas un problème dans les Tm ? Vu que ton amorce est fausse... En tout cas, moi je n'ai jamais vu de smire dans les cas où mon amorce n'était pas bonne.

Bon courage, j'espère que d'autres étayeront ma réponse, je ne te sers pas à grand chose là.

C'est sur qu'un mismatch au milieu d'une amorce, ça n'aide pas.

Donc avant de tenter autre chose, commence par te procurer une paire qui a une chance de fonctionner. D'ailleurs au prix des amorces tu pourrais designer deux ou trois couples pour être sur.
Ensuite, si tu peux, testes les sur un gradient de température pour optimiser la réaction.

Enfin, il est normal de ne pas avoir de smear avec une seule amorce.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited20cd97b]

Merci pour vos reponces rapides.
Bon tant mieux, si les bases semblent etre le probleme. En fait j'ai commandees de nouvelles amorces des que j'ai vus le probleme.
Ce m'inquiettait surtout, c'est le fait de ne vraiment absolument rien voir sur mes bandes, alors que je me serait attendus a un smear. Mais en effet il m'a suffti de faire un piti schemas sur un bout de papier pour comprendre que avec une seul amorce, l'amplification n'etait pas exponentiel et donc trop faible pour etre visible.

Merci encore

[kamor]

Autre question... Mon autre amorce etant tout a fait bonne, est il normale que je ne vois rien sur mon gel?
J'aurais pense voir un smir dans la mesure ou la sequence aurait du etre amplifier dans un sens et s'arreter un peut n'importe ou

Avec une amorce ton amplification sera linéaire. Si aux premier cycle tu as deux brins, au 2ème tu en auras 3 puis 4, etc.
avec deux amorces, l'amplification sera exponentielle, donc 2, 4 , 8, etc.
Dans un cas au bout de 30 cycles tu auras 32 amplicons, dans l'autre 2^30, soit environ 1 milliard
Voir quelque avec si peu d'ADN est impossible, même si ton nombre de départ est bien sur plus important.

[inviteffc39746]

Mon maitre de stage a fait une faute de frappe en tappant la commande et du coup j'ai un G en trop en plein milieux de mon amorce.

Donc là c'est même pas un mismatch c'est carrément une base en plus d'après ce que tu dis donc c'est complétement normal que ta PCR ne marche pas puisque ton amorce après ta base en plus ne s'hybride plus. T'auras beau changer ce que tu veux je ne pense pas que tu arriveras à en faire quelque chose. 1 mismatch passe encore tout dépend où elle se situe. Par exemple il vaut mieux les avoir en 5' qu'en 3' et au milieu ça peut gêner mais tout dépend de la longueur de ton amorce.

[invitedeb0206a]

Qu'elle est la taille de l'amplicon attendu?

[invited20cd97b]

Bonjour,
Tout d'abord merci pour votre aideL'amplicon attendus devrais faire 150pb...

Bon sinon les nouvelles amorces sont arrive, mais la rection ne marche toujours pas...

Du coup j'ai tente de faire un controle positif avec une sequence deja amplifiee par mon labo et avec des primers qui marchent, et la toujour zero bandes...

J'ai essaye de changer de stock de DNTp, de changer de kit a PCR, et toujours zero bandes...

Je commence a penser que les dieu de la PCR sont contre moi...
Le plus rageant dans tout ca c'est que la toute toute premiere PCR que j'ai fait a marchee mais etait contaminee...
Et bien entendus je vois pas ce que j'ai fait de different cette fois ci...


Si vous avez une sugestion, je suis preneur...

[kamor]

Si tu n'as pas de bandes avec une autre PCR, c'est peut être ton électrophorèse qui est à vérifier.
Tu peux quantifier l'ADN après PCR si tu as encore ton tube en faisant une lecture à 260/280 nm pour confirmer qu'il n'y a rien. Ah et avant, que tu aies quand même de l'ADN dans le tube
S'il n'y a vraiment rien...Bon courage, car il semble que tu as déjà testé les constituants de ton mix.
Vérifier que tu utilises le bon protocole (on sait jamais) sinon difficile à dire comme cela.

[invited20cd97b]

En fait je me suis deja posee la question d'un probleme d'electrophorese.
Mais ma premiere pcr (celle qui a marche mais qui etait contamine et en plus n'avait pas les bion primers) laisse bien apparaitre des bandes... (j'ai retente hier)
Donc le probleme doit pas venir de l'electrophorese...

Je commemce a penser que je vais devoir faire des incantation et des danses tribales autour du thermocycleur

[kamor]

Je déconseille, l'accès autour des thermocycleurs est souvent malaisé donc il est difficile d'en faire le tour
Blague à part, vérifie la pureté de ton ADN si ce n'est pas déjà fait, trop de protéines ou de sels par exemple peuvent inhiber une PCR

[inviteffc39746]

Petite question toute bête : tu es le seul à utiliser le thermocycleur dans ton labo ??? parce que ça peut tout simplement être le thermo qui est en panne ... après je n'ai plus d'idée moi désolé

[Flyingbike]

quel est ton programme ? tu es sur de la machine ?

[invited20cd97b]

A mon avis le programme est bon (je l'ai re-regardee avec mon maitre de stage), et je suis le seul a toucher au thermocycleur.
Par contre je pense pas que la machine sois HS, car elle m'a quand meme sortis une PCR qui a marchee, mais contaminee.

[Flyingbike]

tu as essayé de diminuer la température d'hybridation ?

[invited20cd97b]

Oui. J'ai tente de la passer de 55 a 50C, mais sans resultats...

[inviteffc39746]

qu'est-ce que t'entends par contaminé ?
Sinon ta machine a pu tomber en rade après ta 1ere PCR c'est pour ça que je te demande si t'es sûr qu'elle marche ...
as-tu accès à des amorces qui ont déjà fonctionner en routine dans ton labo pour vérifier si ton thermo n'est pas HS ?

[invited20cd97b]

Par contamine j'entend que j'ai eut une amplification dans mon temoin negatif (mix PCR + H2O a la place de l'ADN).
oui en effet la machine pourrait etre tombe en rade mais j'ai aussi fait quelques une de mes tentatives de PCR dans une autre machine, sans succes.
Qu'entend tu par "en routine"?

[inviteffc39746]

En fait je voulais savoir si dans ton labo il existe des amorces qui sont souvent utilisées par d'autres tech et qui marche très bien pour vérifier si ta machine fonctionne ou pas. Mais puisque tu dis que tu as essayé d'autre thermo sans succès alors ça ne doit pas être ça.

Tu peux récapituler tous les tests que tu as faits comme ça on aura une vision d'ensemble pour voir ce que tu peux tenter à nouveau car là je sèche. En plus il se peut que d'un coup au moment où tu fais ça un truc te saute au yeux !

[invitec4829296]

Il m'est arrivé une fois de commander le primer reverse du mauvais brin (séquence inverse au lieu de inverse complémentaire)...
Du coup les 2 amorces vont dans le même sens au lieu d'être face à face et donc il n'a pas d'amplification.

Tu essayes d'amplifier sur de l'ADN génomique ou sur des ARNm (ADNc) ?
Ca arrive qu'un exon présent sur l'ADN génomique soit excisé dans l'ADNc (épissage alternatif).

Autre piste : demande à quelqu'un d'autre de faire la manip...

J'aurai tendance à ne pas pas faire confiance à ta 1ere PCR positive (combien de fois, ça m'a perdu. Je croyais être sur une bonne base et en fait non). Je pense comme jugen : Vérifie que tu arrives à amplifier un autre gène avec des amorces validées sur ton échantillon. C'est la seule façon de savoir que le problème vient bien des amorces.

Bon courage

[invited20cd97b]

Merci a tous pour vos conseilles.
J'ai enfin trouvee d'ou venait le probleme, mais attention c'est ridicule...
Je pensait que le toit chauffant du thermocycleur s'enclanchait automatiquement... Bah non il fallait que je le rentre dans mon programme... Du coup vus que toute l'eau se condenscait en haut du tube, la reaction pouvvait pas se faire...



Bon j'ai un peut honte, mais au moin je suis super contant d'avoir trouve d'ou venait le probleme. Y'a plus qu'a aller feter ca au pub.



Encore merci pour votre aide.

[Flyingbike]

[kamor]

Ce que les stagiaires peuvent inventer comme excuse pour aller au pub quand même...
Au moins tu peux être sur de ne plus jamais oublier ce petit "détail".
Cheers

[inviteffc39746]

Et bien pour le coup moi aussi je vais retenir ça si jamais j'ai a travailler avec ce genre de machine parce que là je n'aurais jamais pensé à ça !!!!

ps : n'es pas honte, aucune machine ne fonctionne pareil. Entre celles dont le capot ne chauffe pas, celle qui chauffe obligatoirement et celles qui faut régler il y a de quoi se tromper