Etapes de mise au point qPCR - gène peu exprimé

[invite9548ca4c]

Bonjour à tous,
Je n'ai jamais eu de "réelle" formation qPCR, et j'aimerais qu'on partage nos expériences. Je vais vous raconter les étapes de mise au point de ma qPCR sur un gène peu exprimé dans les cellules de peau, et j'aimerais bien vos commentaires, ce que vous auriez fait de plus ou de moins, ou différemment.

ETAPE 1
J'ai designé plusieurs couples d'amorces, avec différents logiciels (NCBI primer designing tool, Roche.com, primet set). J'ai blasté les amorces obtenues pour vérifier qu'elles allaient bien spécifiquement sur mon gène et j'ai aussi évalué leur potentiel de self-dimère et hétéro-dimère ainsi que le hairspin (sur idtdna.com). Jusque là tout allait bien.
PS : quel logiciel utilisez vous ?

ETAPE 2
J'ai passé en qPCR tous mes couples d'amorces parallèlement à mes 2 gènes housekeeping préférés, sur des ADNc de cellules qui surexpriment mon gène en faisant des gamme de dilution de mes ADNc de 10-1 à 10-5. Grosse déception, seuls 2 couples sur les 6 designés ont eu une courbe de fusion acceptable, et une efficacité correcte. Mais ces deux couples d'amorces me donnaient des CT de 36 à 40... Bof bof.

ETAPE 3
Je suis repartie de la RT. Avant, je l'avais faite avec 1 µg d'ARN pour un volume réactionnel de 20 µL (comme d'hab dans mon labo).
La, j'ai mis le maximum d'ARN pour 20 µL, soit 5 µg.
Et j'ai repassé mes ADNc en qPCR. Avec des dilutions au 1/10 (de 10-1 à 10-5) mais aussi avec des dilutions au 1/5 (de 1/5 à 1/625) et au 1/4 (de 1/4 à 1/125).

BILAN
Mes conditions idéales sont :
- RT sur 5 µg d'ARN / 20µL
- dilution des ADNc de 1/5 en 1/5
Et encore, c'est pas le top du top, je n'arrive pas à avoir une efficacité supérieure à 92 % !!

Vos suggestions ? Vos trucs et astuces ??

Merci d'avance !
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[invitedeb0206a]

Une efficacité de 92% c'est déjà pas si mal étant donné que tu est encore dans la mise au point non? en effet les Ct sont élevées... surtout pour les cellules exprimant fortement le gène, peut être y a t'il dégradation de tes ARN avant la rétro-transcription. Vous utilisez bien de l'eau RNase free? peut être un soucis lors de l'extraction?

[invite9548ca4c]

C'est vrai qu'une efficacité de 92 % c'est pas mal.
Concernant l'extraction d'ARN, je ne pense pas qu'il y ait de souci puisque j'ai fait migrer mes ARN dans une puce de bioanalyzer Agilent 2100 et ils sont nickels. J'ai utilisé de l'eau RNase free.
Et mes gènes housekeeping sortent parfaitement en qPCR sur ces échantillons.

Je me demande si je devrais pas utiliser d'autres amorces ? As-tu un logiciel à me conseiller pour le design ?

J'aimerais vraiment optimiser mon efficacité...

[invite853321bf]

C'est plus que pas mal, c'est très bien 92 %.
Avec une telle efficacité, elle serait acceptée sans problème.
Vous pouvez sinon tester d'autres conditions, en jouant sur la température, concentration d'amorces et [MgCl2]. Ca peut jouer mais un peu, je serais très surpris que vous gagniez 10 ou 15 Ct comme cela (vos Housekeeping sortent vers combien au juste pour parfaitement ?)
Pour les logiciels... Perso j'en utilise un qui a été acheté en même temps que le thermocycleur et comme les autres logiciels dispo, il a ses "bons moments" et ses très mauvais. J'ai un couple d'amorces qui matchent très bien, plusieurs autres qui sont dans les choux. Pourquoi ? ça c'est la question.
J'ai pas l'impression qu'il y ait d'autres recettes miracles que de tester différents couples.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite7f1ed9f4]

Effectuez-vous en parallèle sur vos échantillons des NRT (rna non rétro-transcrits), réalisés dans les mêmes condition que les RT mais sans enzyme?

Grace à ces derniers, et à condition de réaliser des courbes de melting a chaque run, vous pourriez ainsi estimer si vos Ct (très élevés...) sont réellement dus à une amplification spécifique de cDNA ou s'il s'agit de dimer de primer.

Avez-vous designé l'un des primers (reverse ou forward) sur une jonction exon exon afin d'éviter l'amplification d'éventuelles contamination génomique?

Pour ce qui est le niveau d'expression faible, vous pourriez envisager un "priming" en introduisant dans votre réaction de RT les amorces pour votre cible.

[invitec4829296]

Moi aussi, je chercherai d'autres amorces. C'est tellement plus simple après.
L'idéal c'est de pouvoir les tester sur de l'ADN génomique. L'avantage c'est que tous les gènes sont présents à la même concentration.

Par contre, 92% d'efficacité c'est trop peu. C'est qu'il y a des interférences. Mon seuil c'est 96% (famille de gènes très conservés oblige).

J'utilise oligo 4 (sur Mac) pour les dimères et les hairpins, et le logiciel de Perkin elmer fourni avec l'appareil pour les températures d'hybridation.

Tu as mis 3 G/C à la fin pour bien ancrer les amorces ?

[invite853321bf]

Par contre, 92% d'efficacité c'est trop peu.

Selon VOS critères.