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Se débarasser de l'activité enzymatique résiduelle dans une cellule



  1. #1
    katsiah

    Se débarasser de l'activité enzymatique résiduelle dans une cellule

    Salut !

    Dans mon stage où je dois visualiser les profils d'acyles-CoA en LC/MS-MS, je dois traiter des culots de cellules de malade MCAD ( maladie où la protéine MCAD subit des mutations l’empêchant de dégrader des acides gras à chaine moyennes lors de la réaction de beta oxydation, et entrainant leur accumulation).

    Le problème c'est que je veux visualiser le défaut qui sera représenté par une accumulation des acides gras à chaines moyennes, mais ce défaut risque d’être mal vu à cause d'une possible activité résiduelle de l’enzyme qui dégrade des acides gras et du coup je verrais pas l'accumulation de ces dernier attendue.

    j'ai pensé à éliminer cette activité résiduelle en confrontant les cellules à un choque de température élevée ou utiliser de l’acétonitrile, il y a aussi une troisième possibilité dont je suis pas encore sure c'est de faire un choque de température bas dans l'azote par exemple...

    Pouvez vous m'aider s'il vous plait si vous avez déjà été confronté à ce problème, quelle est la méthode qui parait la mieux et si vous avez d'autres idées testées plus efficaces merci ^^

    -----


  2. #2
    Flyingbike

    Re : Se débarasser de l'activité enzymatique résiduelle dans une cellule

    a un moment donné vous devez extraire les AG, non ? Quelle méthode ?
    La vie trouve toujours un chemin

  3. #3
    katsiah

    Re : Se débarasser de l'activité enzymatique résiduelle dans une cellule

    Oui en effet après la culture des cellules, on les lyse par des cycles congélation décongélation et on travail sur les culots cellulaires qui contiendrons nos acyles CoA qu on veut visualiser
    J'ai vu des publi qui utilisent du TFA à 1% aussi comme techniques ça m parait pas mal à tester...

  4. #4
    Flyingbike

    Re : Se débarasser de l'activité enzymatique résiduelle dans une cellule

    quelles cellules ?

    Pour des dosages métaboliques en hépatocyte on lyse avec du TCA, pour précipiter toutes les protéines, et ensuite on neutralise le surnageant avant dosage.
    Pas d'activité résiduelle
    La vie trouve toujours un chemin

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