le diagnostic par RT-qPCR multiplexe : problèmes de lecture des fluos!

[invitec5bdec18]

Bonjour à tous

J'ai besoin de votre aide pour le problème suivant:
J'ai mis au point des RT-qPCR en multiplex avec les 4 fluos suivant : FAM / HEX/ TEXAS RED/ Cy5 .
J'ai d'abord mis au point les simplex de façon indépendante . J'ai ensuite testé le tout en multiplex . Cela fonctionne toujours bien mais il y a quand même un problème : lorsque je mélange les 4 ARNs avec leurs 4 couples amorces/sondes il n'y a pas de soucis. Par contre , lorsque je mélange les 4 couples amorces/sondes + 1 SEUL ARN et bien la machine sort des CT dans les canaux correspondant aux autres ARNs non présents dans le mélange. Je précise que tout les éventuels problèmes de spécificité avaient été testés au préalable in silico mais aussi en manip .... J'utilise le CFX96 de Biorad et le LC480 de Roche . Le problème est visible avec les 2 machines.

J'ai besoin de votre aide car le but de ma manip est de pouvoir identifié un pathogène dans un échantillon inconnu, donc si tout sort tout le temps je vais avoir un soucis ....

MERCI d'avance!
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[Flyingbike]

elle sort des ct ça ne veut rien dire. Certaines machines sortent des Ct sur du bruit de fond juste parce qu'on leur demande de sortir un Ct.

Regardez votre signal brut et les courbes de signal, des fois vous avez un profil de hérisson et un ct a 15... pourtant le signal max ne dépasse pas celui d'un contrôle négatif....