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immunofluorescence



  1. #1
    cocquelicot

    immunofluorescence

    Bonjour à tous.

    J'ai fait un marquage sur des lames paraffine avec le marqueur neuronal NeuN. Cependant j'ai deux marquages qui coexistent sur la lame et qui sont assez différent. Est-ce déjà arrivé à quelqu'un? Si oui, quel est le problème? Si non, est-ce quelqu'un a une idée?

    (le marquage total, nucléaire est le bon à priori)

    Merci NeuN-Image Export-01.jpgNeuN-03-Image Export-03.jpgNeuN-02-Image Export-02.jpg

    -----


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  3. #2
    Flyingbike

    Re : immunofluorescence

    Quel tissu/cellules ?
    Quel secondaire ?
    Un contrôle négatif ?
    On s'attend à quel marquage ?

    Visiblement un bruit de fond important
    La vie trouve toujours un chemin

  4. #3
    cocquelicot

    Re : immunofluorescence

    Ce sont des coupes de cerveau de souris âgées de 6mois à peu près
    L'AC primaire est donc NeuN un marqueur des neurones (à peu près tous) et le secondaire est un Alexa fluo 488 anti mouse.
    J'ai un contrôle neg entièrement négatif cf photo
    On s'attend normalement au marquage rempli pas celui au contour du noyau. mais j'ai les deux marquages sur à peu près toutes mes lames (20). NeuN-12-Image Export-12_c1.jpg

  5. #4
    cocquelicot

    Re : immunofluorescence

    Il y a un grand bruit de fond mais c'est normal. le cerveau de souris a une autofluorescence assez importante

  6. #5
    Flyingbike

    Re : immunofluorescence

    C'est pour ça que je demandais quel tissu c'était
    En plus d'utiliser un secondaire anti mouse sur un tissu plein d'IgG
    Quel blocage ?
    Vous avez déjà eu un marquage comme attendu ?
    La vie trouve toujours un chemin

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    cocquelicot

    Re : immunofluorescence

    J'ai le même bruit de fond quand je prends des anti goat ou rabbit.
    Oui j'ai eu le marquage attendu il est présent sur deux photos que j'ai montré. une a le marquage plein, une le marquage contour et une autre le double marquage. Normalement je devrais avoir que le marquage plein donc je ne comprends pas d'où ca vient...

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  10. #7
    Flyingbike

    Re : immunofluorescence

    Ça ne peut pas être votre protéine ? Le marquage perinucléaire n'a pas l'air d'être là au hasard
    Ça ne peut pas être lié à un groupe particulier de souris ?
    La vie trouve toujours un chemin

  11. #8
    cocquelicot

    Re : immunofluorescence

    je suis d'accord sur le fait que le marquage a l'air spécifique. Mais j'ai le même problème dans mes souris contrôles.
    Pensez vous que cela puisse être un problème de manipulation? Les lames auraient séchées et donc le marquage ne serait pas rentré correctement dans le noyau ou bien pas assez de Tritton dans le PBST...
    Ou pensez vous que c'est à cause des échantillons et que la protéines est disposée comme ca ?

  12. #9
    Flyingbike

    Re : immunofluorescence

    Aucun moyen de le savoir, mais je pense pas que ça soit une histoire de manip
    Vous avez ça sur toute une série, dans tous les groupes ?
    Alors que normalement ça ne le fait pas du tout ?

    C'est peut être un truc qui a affecté toute la série (âge, rythme circadien, régime, n'importe quoi d'autre)
    La vie trouve toujours un chemin

  13. #10
    cocquelicot

    Re : immunofluorescence

    Là sur 40 échantillons : 20 contrôle et 20 malades (je parle notamment du cortex là) j'en ai 6 qui sont avec le marquage attendu et donc 34 avec le marquage perinucleaire. Mais, les échantillons qui ont le marquage périnucléaire ont des endroits dans le cortex où il y a le marquage entier. Alors qu'il y a des échantillons où je n'ai que du marquage total et pas que périnucléaire. Cependant, autour et dans l'hypothalamus je n'ai que du marquage attendu pour toutes les lames par exemple.
    Non, normalement ca ne le fait pas du tout ...
    Normalement rien n'a été changé pour ces souris ...

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