Bonsoir, j'aimerais séquencer des produits de PCR temps réel et comme ce sont des petits fragments , je ne sais pas est ce que c'est possible de les séquencer et est ce que il y a une technique ou une astuce pour séquencer les produits de PCR temps réel . Merci
Rien en particulier
Respecter les quantités/volumes préconisés par le fournisseur du service
On peut utiliser les mêmes amorces
Souvent il est recommandé de nettoyer les produits de pcr (sur colonne par exemple) mais ça fonctionne bien sans (en general il faut diluer le produit)
Vu la taille (<300bp), on est sur de tout couvrir avec un read sur chaque amorce
La vie trouve toujours un chemin
Merci Flyingbike pour votre réponse. Le problème avec la PCR à temps réel c'est que j'utilise une sonde fluorescente et ça peut me gêner lors du séquençage, et ce qui serait bien c'est d’éliminer cette sonde pour pouvoir essayer de faire un séquençage
De base, on va plutot envoyer à séquencer un transcrit PCR classique (du tube pcr ou apres visulatisation sur gel et extraction de la bande) cependant rien n'empêche de prendre le produit qPCR, il suffit de le purifier en enlevant le tampon et la polymérase (bien que je ne sois pas sur que ca interfère vraiment, mais dans le doute)
une purification à l'acétate de sodium/ethanol devrait faire l'affaire ensuite tu resuspends dans le volume approprié en eau distillé ou en tampon TE au choix
Si tu as peur d'utiliser acetate de sodium/ethanol tu peux toujours utiliser un kit de purification PCR (plus cher), dans ces kits il y a bien souvent deux types de réactifs, les réactifs pour purification sur gel et les solution pour une purification en tube pcr sans passer par gel, ces kits utilisent des membranes sur colonnes que tu élue au final avec l'éluant de ton choix
Merci Loupsio , je ferai ce que vous m'avez recommandé et je vous dirai si ça a marché
Sinon la purif peut aussi se faire par la boite de séquençage...Nous on envoie directement et c'est eux qui font la purif, le seul truc c'est qu'il faut envoyer un peu plus en quantité (volume de 30uL) et leur preciser ce qu'l faut purifier (ici le sybr).
