PCR en temps réel

[quellecmanon]

Bonjour,

Je dois exploiter les résultats que j'ai obtenu lors de ma PCR en temps réel. Elle a été effectuée sur des plants de riz transgénique et on cherche à savoir la quantité de protéine présente dans ces plants de riz.

Or je n'arrive pas à comprendre comment discuter des figures et trouver la quantité de protéine présente.
C'était la première fois que je faisais une RT-PCR, c'est pour cela que je viens vers vous si quelqu'un peut m'éclaircir.

Je vous mets les photos en pièce jointe.

Merci,
Manon

Amplification Plot All.jpgMelt Curve.jpgStandard Curve target.jpg
-----

[Flyingbike]

Pour commencer, vous n'aurez pas une quantité de protéine mais une quantité de transcrit. Ce qui peut être relié mais pas forcément


Ensuite, il manque des informations : à quoi correspondent les deux droites obtenues ? quels sont leurs paramètres (pente, R², etc)

quels sont les résultats brut en Ct ?
Y a-t-il un controle négatif ? un gène de référence ? etc....

[quellecmanon]

L'analyse a été faite sur deux échantillons de riz transgénique, ce à quoi correspondent les deux courbes.
Il y a 3 témoins négatifs pour chaque puis tout a été fait en triplicat.

Pente Ordonnée à l’origine R² Rendement
R1F1 Prol1 -3,533 20,653 0,968 91,894
R1F2 Prol1 -3,534 23,139 0,975 91,859

La droite bleu correspond a la première ligne du tableau et la droite jaune a la seconde.
Les noms tout à gauche sont les couples d'amorces utilisés.

Où est-ce qu'on trouve les résultats brut en Ct ?

[Flyingbike]

Euh, c'est Applied Biosystems ? Dans l'onglet Analysis, Amplification plot, si ma mémoire est bonne
A droite il y a le plan de plaque, si les Ct n'y figurent pas, cliquer sur analysis

Et joindre un plan de la plaque


En attendant, vous avez de belles courbes !

[A voir en vidéo sur Futura]

[quellecmanon]

Voilà le plan de plaque avec les Ct dessus

[Flyingbike]

Ok je regarde ca bientot

[Flyingbike]

Bon, je vais essayer de faire simple et complet, a peu près

Pour la PCRq, il y a plusieurs paramètres à prendre en compte pour s'assurer de ne pas faire dire n'importe quoi à ses résultats (ça arrive trop souvent)

Déjà, il faut comprendre ce qu'on observe : le paramètre mesuré est un signal dont l'intensité dépend de la quantité d'intercalant "intercalé" dans l'ADN double brin. Ainsi, la différence de signal entre le début et la fin du run correspond à tout ce qui a été amplifié pendant le run. C'est le coté quantitatif. Autre avantage, ce signal est réversible : en chauffant, on dénature l'ADN double brin et le signal s'effondre. Par ce moyen, on peut connaitre la température de fusion des produits amplifiés.

Commençons par cela : l'image du milieu présente justement l'abondance relative de l'ADN en fonction de la température de fusion. Elle a été obtenue à la FIN du run, une fois que l'amplification est terminée, lorsque l'appareil effectue une rampe de température tout en mesurant le signal. Ici : un pic majoritaire, qui correspond très certainement au point de fusion de votre produit de PCR cible, celui que vous vouliez amplifier, entre vos deux amorces. Les quelques pics en dessous de 74° correspondent sans doute à vos contrôles négatifs : souvent ils donnent un signal non spécifique qui correspond a du bruit de fond. C'est donc bien et normal (du signal spécifique dans les négatifs et votre PCR n'est pas interprétable)
Note : le Tm donne une indication de spécificité, mais vous pouvez avoir plusieurs produits différents qui produiraient tous le même pic ! Il faut comprendre que pour quantifier une cible ADN, il faut s'assurer qu'on amplifie ce qui nous intéresse et pas n'importe quoi.

Ensuite, courbe d'amplification : votre signal "décolle" a partir d'un certain cycle, jusqu'a atteindre un plateau (pas important). Le moment ou le signal de chaque échantillon "décolle", le "Ct", est directement lié à la quantité d'ADN initiale. C'est d'ailleurs ce qui permet de le quantifier. Plus ça décolle tôt, plus il y en avait au début et plus vite on atteint le seuil ("threshold") fixé par le logiciel ou l'expérimentateur qui va permettre de calculer ce "Ct"
Ici joli profil, les quelques échantillons qui décollent a la fin sont certainement les contrôles négatifs.

Enfin, courbe étalon. Elle permet de corréler la valeur du "Ct" que détecte la machine avec la quantité réelle d'ADN présente dans le tube au début du run. En théorie et comme vous le savez, la quantité d'ADN dans une PCR double à chaque cycle. En théorie oui mais ce n'est pas toujours vrai, et cela dépend de nombreux paramètres (qualité des amorces, quantité initiale, mix, paramètres de cycle, etc...). Pour cela, on construit une gamme de dilutions connues, et on regarde le signal que cela donne. Ensuite, on représente le Ct en fonction de la quantité d'ADN initiale (relative ou absolue), ce qui donne une droite dont la pente est proportionnelle à l'efficacité de l'amplification ("rendement"). Dans votre cas, on est a 91% ce qui est plutôt correct. C'est à dire qu'a chaque cycle on multiplie par 1,8 la quantité d'ADN.

Maintenant qu'est ce que cela veut dire ?
Sous reserve que votre quantité de matériel de départ est la même pour les deux échantillons, on peut effectivement comparer le niveau d'expression de la cible dans ces deux échantillons. Pour cela, pas besoin de la gamme, on compare le Ct de chaque échantillon à concentration identique, en prenant en compte l'efficacité de l'amplification. 1 Ct d'écart correspond à un rapport 2, 2 Ct d'écart à un rapport 4 dans le cas d'une efficacité de 100%. En réalité, on peut calculer ce rapport entre un échantillon et un témoin par cette formule :

Pas besoin de le calculer cependant, puisque le logiciel est fait pour ça.

Une fois arrivé à cela, je me rends compte d'un truc que je ne comprends pas dans votre expérience. Vous voulez comparer deux échantillons, mais vous dites avoir utilisé deux couples d'amorces différents... On ne peut pas comparer deux échantillons amplifiés avec deux couples différents, j'imagine que vous avez compris. Expliquez nous plus précisément ce que vous voulez quantifier (quelle cible) et sur quels échantillons ?

[quellecmanon]

Merci pour toute ces explications.

Oui en effet, on a utilisé deux couples d'amorces différents car on en a designé plusieurs et on voulait voir leur efficacité.
En réalité c'est le même échantillon et ce sont les amorces qui changent.

[Flyingbike]

Ok
dans ce cas les deux sont pas mal ! vous pouvez toujours (je le fais a chaque fois personnellement pour un nouveau couple) déposer le produit de PCR sur gel, pour voir si la taille est bien la taille attendue, ça fait un check supplémentaire