Sondes de Southern Blot et complémentation

[OzymandiasA]

Bonjour à tous;

J'ai quelques questions concernant la technique du Southern Blot et notamment un problème lié aux amorces. Il s'agit d'un problème de compréhension du fonctionnement.

Les amorces utilisées pour le Southern sont créées à partir d'ADNc par complémentation avec des dNTP marqués par radioactivité pour être visibles en autoradiographie. Si j'effectue le Southern sur un génome complet après digestion enzymatique (et dénaturation) comme le demande la procédure j'effectue le Southern sûr de l'ADN qui n'est donc pas épissé. Comment la complémentation est-elle effectuée ? En effet la sonde d'ADNc ne comporte pas les introns. La complémentation se fait elle donc en "*repliant*" l'ADN comme dans l'expérience avec l'albumine ayant mis en évidence les introns dans l'expérience du lieu ci-dessous.

https://sites.google.com/site/banteg...e%20poulet.jpg

J'espère ne pas avoir fait trop d'erreur dans ce message et vous remercie d'avoir pris le temps de le lire.
Cordialement
-----

[dalmia]

Bonjour

Eh bien je pense tout simplement que la sonde ne va être complémentaire que d'un exon du gène si celle-ci est effectivement de l'ADNc. De cette façon, pas de stress entre ADNc et ADNg avec ses éventuels introns.
Attention au terme complémentation qui ne veut absolument pas dire ce que tu entends dans ton post. La complémentation, c'est fournir un gène à un organisme pour compenser un défaut (par exemple, rendre une levure capable de dégrader et donc d'utiliser une molécule pour son métabolisme). Tu peux ici parler d'hybridation entre sonde et cible, mais pas de complémentation.

Je ne suis pas experte du Southern Blot, prends mon hypothèse comme tout à fait possible mais elle n'est peut-être qu'un élément de réponse. Voyons ce que d'autres pourraient ajouter

Dalmia

[OzymandiasA]

Merci pour cette réponse !

Oui je suis désolé de la confusion, j'ai écrit ça un peu tard ... enfin je n'ai pas d'excuses mais merci de me l'avoir fait remarquer.

Pour ce qui est des sondes réalisées uniquement sur un exon je n'ai jamais entendu parler de ça. Effectivement si elles sont faites à partir d'ADNc elles ne sont formées qu'à partir DES exons de l'ADN mais pas d'un seul. Mais c'est plausible en digérant l'ADNc par des enzymes de restriction pour diviser les exons et créer la sonde à partir de ces exons "*libres*" ... j'attends d'autres réponses pour compléter, affirmer ou infirmer cette hypothèse. Merci beaucoup !

[dalmia]

Mais personne ne te demande d'excuses

Il était effectivement implicite dans ma réponse que je ne considère qu'un fragment d'ADNc comme sonde, de façon à hybrider une séquence qui correspond à un exon (éviter qu'elle soit à cheval entre deux exons et donc pas hybridable à l'ADNg).
En moyenne, il me semble qu'une sonde fait 100 à quelques centaines de nucléotides de longueur. Si tu veux détecter la présence d'un gène qui fait 3000 kb, avec un ADNc qui ferait par exemple 2000 nt, c'est bien trop long. Réduire la taille te permet une meilleure hybridation... et d'être intraexonique

Allez les gars, d'autres idées/affirmations ?

Dalmia

[A voir en vidéo sur Futura]