Preparation d'une gamme étalon ou standard pour PCRq
Bonjour,
Je voulais quantifier un gène par PCRq, d’après la littérature un chercheur à utiliser le même gène en utilisant des amorces dégénérées et il indique la souche utilisée pour préparer sa gamme standard mais pas plus de détails.
Avec quoi je commence pour trouver plus d'informations sur comment préparer ou commander concernant la gamme standard ou étalon ? (novice en PCRq) sachant que je vais utiliser les mèmes amorces du chercheur c'est plus simple, je pense
Merci pour votre aide
souvent, on prend un pool d'échantillons, voire un pool d'échantillons dans lesquels on s'attend a avoir un maximum d'expression de la cible, en s'assurant de faire commencer la gamme un peu plus concentrée que les échantillons inconnus
On peut aussi prendre un cDNA issu de cellules transformées, un plasmide, etc....
La vie trouve toujours un chemin
Donc par exemple a partir d'un plasmide comment on peut trouve la sequence en question
Bonjour
Des amorces dégénérées pour de la qPCR? première fois que je vois quelqu'un faire ça,
On peut utiliser des amorces dégénérées pour une PCR classique quand on ne connait pas sa séquence (puisque le but est juste d'avoir une bande), mais pour de la qPCR il vaut mieux des amorces dont on connait la séquence et qui ont toutes la meme séquence, sinon notre calcul des delta Ct doit en être impacté, surtout qu'une fois qu'on a la bande en PCR classique il suffit de l'extraire et de l'envoyer à séquencer afin d'avoir la séquence exacte et de designer des primers pour la qPCR, (en plus avec du dégénéré on augmentelerisque de non spécifique) m'enfin bon, peut etre que Flying qui est bien plus calé que moi sur le sujet a déja vu ca, et que ca se fait tout de même.
Quand tu dis que tu veux préparer une gamme étalon,on est bien d'accord que c'est pour calculer ton "E"?(sachant que 1+E doit etre proche de 2)
Car c'est surement une mauvaise lecture de ma part, mais en te lisant j'ai eu l'impression que tu voulais une gamme pour relier directement a une quantité en ng ou nmol initiale de ton gène, un peu comme en biochimie on prépare une gamme de BSA pour obtenir une concentration de protéines.
Mais en qPCR on obtient une quantification relative par rapport un autre gène
relier ton Ct aux Ct d'ADN de concentration connu je ne suis pas sur que cela puisse se faire puisque x ng ou x nmol ne représente pas une quantité de transcrit (selon la taille des fragments), en plus de ca, dans les quantifications, les nucléotides libres sont aussi pris en compte, les primers aussi...
Dernière modification par Loupsio ; 07/09/2017 à 14h29.
Bonjour,
Oui ça se fait surtout lorsque il s’agit de l'ADN environnementale:
Le lettres correspondants:
R = G ou A
K= G ou T
S = G ou C
W = A ou T
M = A ou C
Y = T ou C
D = G ou A ou T
V = G ou A ou C
B = G ou T ou C
H = A ou T ou C
N = G ou A ou T ou C
Moi, je veux quantifier un gène considéré comme bioindicateur, donc j'ai les amorces (dégénérées avec les séquences connues) ou je peux commander, mais mon probleme je n'ai pas une gamme standard OU 2TALON
Mon protocole:
Gene cible: ADN du gène
Gamme étalon: ??? (dilution d'un extrait de plasmide linéarise contenant le fragment cible d'ADN
Technologies: SYBR Green
Amorces: R/F
Ah tu fais donc de la métagénomique? ce n'était pas précisé
Oui je sais a quoi correspond le code dégénéré, (enfin... pas par coeur ^^) mais c'est vrai qu'en biologie classique c'est plutot risqué, mais je n'avais pas vu que tu faisais de l'environnemental, effectivement si tu cherche non pas la sequence d'un individus mais de tout un ensemble, la souplesse qui est souvent négative dans l'utilisation des primers dégénérés deviens ici un avantage
Par contre c'est bien ce qu'il me semblait, tu souhaite faire de la quantification absolu, c'est théoriquement possible mais pas vraiment fiable
en plus il faut pour ca que : "L’efficacité PCR doit être la même sur le standard ou sur les échantillons." l'efficacité (que j'appelle "E" dans le message précédent) ne sera pas la même dans ton standard (une seule séquence, correspondant un certain nombre de tes primers) et dans tes echantilons (plusieurs variants de séquence donc plus de fixation et d'amplification)
Donc meme si tu as une séquence de ton gène en plasmide, que tu l'amplifie dans des bactéries, que tu l'extrait des bactéries, pose sur gel puis extrait du gel ta bande d'intéret, la purifie puis quantifie, tu auras la concentration que tu pourras diluer et te servir en qPCR, mais la meme quantité de transcrits, sur de l'environnemental ne donnera pas les mêmes résultats (ou alors il ne faut pas que tu utilise des primers dégénérés sur ton témoin car pour une meme quantité de primers tu n'auras pas le même taux de fixation, mais même dans ce cas, ton efficacité "E" ne sera pas la meme entre ton standard et ton echantillon)
Et meme de façon classique (qui n'est pas ton cas) la quantification absolue est risquée, il est préférable de faire de la quantification relative
Merci pour vos réponses,
Moi pour l'instant j'ai rien a part des infos,
Dans l'article en question, l'auteur précise qu'il a utilisé: reference plasmids contain the targed genes of C.metallidurans CH34
Pour économiser du temps et de l'argent, je pense pas faire les étapes que vs avez cité (en plus le plasmide il faut commander car non dispo chez moi)
J'ai simplement le nom de la souche, comment je peux commander le plasmide linéarise contenant la séquence cible avec une concentration connue ?
mERCI
