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Systeme GAL4/UAS



  1. #1
    makomoko

    Red face Systeme GAL4/UAS

    Bonjour à tous,

    Je me permet d'écrire ce sujet car en effet dans la lecture d'un article scientifique, je ne comprend pas trop le fonctionnement du systeme GAL4/UAS utilisé chez la drosophile, dans l’article en question.

    Si vous pourriez m'aider à le comprendre ça m'aiderai beaucoup
    Merci !!

    -----


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  3. #2
    Fraggle Rock

    Re : Systeme GAL4/UAS

    Bonjour,

    la protéine GAL 4 est une protéine de levure. C'est un facteur de transcription. On a découvert, chez la levure toujours, une séquence d'ADN (minimale) qui placée devant une séquence codante (quelconque) suffit à déclencher sa transcription, en présence de la protéine gal4. On a appelé la séquence UAS pour "upstream activating sequence" . La protéine GAL 4 se fixe sur la séquence UAS et déclenche la transcription par l'ARNpol. Les chercheurs ont pensé que cet ensemble facteur de transcription + séquence UAS pourrait être un bon système rapporteur.
    Chez la droso, ce système est beaucoup utilisé. On dispose aujourd'hui de nombreuses souches de drosophile dites "Gal 4". Il s'agit de souches où la protéine GAL 4 est exprimée dans différents tissus, parfois dans un nombre très réduit de cellules ( neurones, cellules musculaires, tégumentaires...) sous le contrôle de séquences régulatrices.
    Et par ailleurs, on dispose de nombreuses souches "UAS" qui comportent un transgène avec les séquences UAS devant la séquence codante d'un gène choisi. Par exemple le gène codant la GFP, qui fluoresce quand on l'expose à une lumière UV au microscope.

    Résultat : par exemple, si je croise la souche "GMR-gal4" qui s'exprime dans les yeux de la drosophile, avec la souche UAS-gfp, j'obtiendrais des individus qui ont les deux transgènes et dans leurs yeux, la protéine GAL 4 activera la transcription de l'UAS-gfp, après traduction par les ribosomes, on aura des protéines fluorescente GFP dans les cellules des yeux. Et au microscope, je pourrais observer les yeux de droso en fluorescence.

    Si à la place de GMR-gal4, je prends une souche où gal4 est exprimé dans le système nerveux, pareil après croisement j'aurais des individu qui ont les neurones qui fluorescent.

    Si à la place de UAS-GFP, je prends une souche UAS-reaper, qui est un gène qui déclenche l'apoptose, après croisement avec GMR-gal4, j'aurais des droso, sans yeux...

    Des collections énormes de souches sont disponibles, et les possibilités d'expériences sont presque infinies.

  4. #3
    makomoko

    Re : Systeme GAL4/UAS

    Bonjour,
    Premièrement déjà merci pour la réponse Fraggle Rock, ça m'a beaucoup aidé pour comprendre le mécanisme de ce système. Par ailleurs, j'aurai d'autre questions à te poser :
    1/ Comment les séquenecs GAL4 et UAS sont inserées dans la drosophile ? Par manipulation génétique je pense. Pour la protéine GAL4, elle peut être inserée par KO, non ?

    2/ Dans une phrase, tu dis on va croiser deux souches de drosophile: l'une GMR-GAL4 qui s'exprime dans les yeux. Comment peut-on spécifier le territoire d'expression ?

    Et enfin, une dernière question, dans mon article on utilise du LacZ donc ainsi pour révéler le territoire d'expression, on va utiliser du X-Gal, ça me parait un peu bizarre ?

    PS: Je me permet de mettre en pièce jointe la photo de mon article en question qui traître de cette manipulation.

    Désole avec toute mes question =(
    Merci encore !

  5. #4
    Fraggle Rock

    Re : Systeme GAL4/UAS

    Pas de problème, ces questions sont très pertinentes. Elles me montrent que tu as compris ce que je t'ai raconté. Et elles correspondent à ce que j'avais volontairement choisi de ne pas t'expliquer, pour limiter la lourdeur du propos.
    Donc, le complément qui te manque c'est : comment on fait les souches de droso gal4 ?
    Tu as raison, bien sûr c'est de la transgénèse, mais ensuite il y a plusieurs possibilités. La principale technique de transgénèse, utilisée depuis des décennies chez la droso utilise un transposon naturellement présent chez la drosophile qu'on appelle "l'élement p".
    On utilise des séquences d'élément p modifiées qu'on insert dans un plasmide. En l'occurrence, dans ce plasmide, on va mettre le gène gal4 entre les "pieds de p". Ce sont les séquences 5' et 3' de l'élément p qui vont s'exciser du plasmide pour aller ensuite s'insérer aléatoirement dans le génome. Cela se fait grâce à une enzyme qui est normalement codée par le transposon et qu'on appelle la transposase. Ici, notre élement p modifié ne contient pas le gène de la transposase, sinon une fois inséré dans le génome, il continuerait à transposer. Mais on met le gène de la transposase dans le plasmide, en dehors des pieds de p, pour que le transgène transpose une seule fois dans le génome. On aura alors une insertion aléatoire, mais stable.
    Reste plus qu'à injecter des embryons de drosophile avec une solution de plasmide et à sélectionner des individus ayant le transgène.
    Ce système a été beaucoup utilisé en "enhancer trap" (piège à enhancer). Cela veut dire qu'entre les pieds de p, on met gal4 derrière un promoteur faible (promoteur minimal), ensuite suivant l'endroit où s'insert le transgène, il suit l'expression du gène près duquel il est inséré. De cette façon, dans les années 90, un grand nombre de lignées enhancer trap a été généré, certaines exprimées dans le cerveau, d'autres dans les ailes, dans les soies du thorax, etc... Il fallait étudier le profil d'expression du transgène grâce à un gène rapporteur, puis les lignées étaient mises à la disposition de le communauté, pour ceux que ça intéressaient.
    Au passage, le gène lacZ a beaucoup été utilisé comme gène rapporteur (il l'est surement un peu moins aujourd'hui) , en complément de la GFP et avant qu'on utilise la GFP. La réaction béta-galactosidase présente l'avantage d'être très sensible. Si tu dois screener 300 lignées pour trouver celles qui s'expriment dans le cerveau, il vaut mieux utiliser lacZ, en laissant agir la béta-gal pendant 12h tu verras surement de grosses taches bleue apparaître, visible à l'œil nu, même si ton transgène ne s'exprime que dans quelques cellules. Mais, ce n'est pas très précis, donc si tu veux voir ensuite précisément dans quelles cellules il s'exprime, il vaut mieux prendre la GFP.

    Une autre approche est la suivante : si tu t'intéresses à une gène particulier, que tu aurais identifié par lecture de la séquence par exemple, tu peux isoler ses séquences régulatrices, même grossièrement, et les placer devant gal4, dans ton transgène. Une fois inséré, l'expression du transgène devrait suivre celle de ton gène d'intérêt, avec souvent des variations d'intensité suivant la localisation du transgène dans le génome (effet de position).
    C'est le cas de GMR-gal4, la séquence GMR est une répétition du promoteur du gène glass, qui s'exprime dans les yeux de la droso.

    Pendant très longtemps, le KO n'était pas maitrisé chez la droso. Il fallait donc se contenter d'insertions aléatoires. Puis, dans les années 2000, on a mis au point une technique de KO qui permettait d'insérer gal4 (ou autre) dans un gène ciblé, tout en l'inactivant.

    Plus récemment, une autre technique de transgénèse ciblée a été mise au point. A présent, on peut insérer les transgènes, dans des cites neutres bien identifiés, toujours les mêmes, sur chaque chromosome, pour éviter les effets de positions.

    Voilà, ça suffit pour aujourd'hui, bonne nuit.

  6. #5
    makomoko

    Re : Systeme GAL4/UAS

    Bonsoir,
    Merci encore une fois pour ta réponse super complète ! D'après ce que tu m'as dis sur la méthode expérimental, j'ai rédiger une sorte de "protocole" décrivant toute les étapes pour obtenir une drosophile GAL4-UAS-LacZ je me permet d'écrire ce que j'ai noter :

    1/Insertion du GAL4 avec un promoteur GMR en amont de ce gène dans l'élément P à l'aide d'enzyme de restriction ? pour retirer le gène dont le produit conduit à la transposase (enzyme) ; on obtient donc un élément P modifié.
    2/ Insertion de cet élément P modifié dans un plasmique bactérien. Ce plasmide contient en plus Amphi-r (gène de séléction ?)
    3/ insertion de ce plasmide modifié dans des embryons de drosophile. Grâce un GMR, on aura l'expression de GAL4 uniquement dans le tissu oculaire ?
    4/ Selection des drosophile GMR-GAL4 à l'aide d'une exposition à l'amphiciline. Les drosophile transgenre GMR-GAL4 résistante à l'Amphicilline = intégration du plasmide

    A l'issus de ces étapes, on a des drosophile GMR-GAL4

    5/Insertion de LacZ avec un promoteur UAS en amont de ce gène dans l'élément P à l'aide d'enzyme de restriction ? pour retirer le gène dont le produit conduit à la transposase (enzyme) ; on obtient donc un élément P modifié.
    2/ Insertion de cet élément P modifié dans un plasmique bactérien. Ce plasmide contient en plus Amphi-r (gène de séléction ?)
    3/ insertion de ce plasmide modifié dans des embryons de drosophile.
    4/ Sélection des drosophile GMR-GAL4 à l'aide d'une exposition à l'amphiciline. Les drosophile transgenre UAS-LAcZ résistante à l'Amphicilline = intégration du plasmide

    A l'issus de ces étapes, on obtient une lignée de drosophile UAS-LacZ
    6/On croise les deux lignées de droso transgène : d'une part GMR-GAL4 et d'autre part, UAS-LacZ
    7/ Sélection de cette descendance via l'amphicilline
    8/Ainsi,
    -Le facteur de transcription spécifique à l'oeil se fixe sur GMR
    -Activation expression du gène GAL4: synthèse de la protéine GAL4
    -La protéine GAL4 va se fixier sur UAS et ainsi activer l’expression du gène LACZ dans le tissu oculaire
    9/ Révélation de l'expresison de LacZ avec du X-Gal ?

    Si tu remarque bien dans certaines étapes, j'ai mis un point d'interrogation cela siginifie que je ne suis pas sur de mes propos

    ------------------
    Autre question: Dans mon article scientifique, on observe l'expresison de LacZ à différents endroits, cela signifie qu'il n'y a pas besoin de GMR si je comprend bien ? je t'envoie le lien de mon article scientifique: http://archive.is/GRxgV#selection-575.5-575.72

    Merci encore !!Bonne soirée

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Fraggle Rock

    Re : Systeme GAL4/UAS

    C'est pas mal, mais la réalité est encore un peu plus compliquée :
    il y a bien un gène de résistance à l'ampicilline (sans le h) dans le plasmide, ou à un autre antibiotique, mais il ne sert pas chez la droso. On l'utilise pour construire et cloner le plasmide chez les bactos.
    Au passage, il existe de nombreux plasmides avec des éléments p modifiés, on n'est pas obligé de repartir de 0 à chaque fois. Il y a des plasmides avec des p-gal4, il ne reste plus qu'à cloner les séquences régulatrices qu'on veut dans un site de restriction devant gal4.

    La sélection des droso transgéniques ne se fait pas comme ça, mais tu ne peux pas le deviner puisque je ne te l'ai pas encore expliqué.
    Dans l'élément p modifié, on met aussi un gène appelé mini-white (w+), c'est une version minimale du gène white qui permet de restaurer des yeux colorés chez des droso mutantes pour le gène white. Les sauvages w+ ont les yeux rouge-brique, les mutants w- ont les yeux blancs. La souche de départ, dont on va injecter les embryons est une souche w- (yeux blancs). Les transgéniques au final auront les yeux colorés, qui peut varier du jaune très pâle, au rouge vif, en passant par toutes les nuances de orange (!!) cela dépendra du point d'insertion du transgène et de son niveau d'expression (effet de position, encore).
    Les embryons qui ont été correctement injectés, à condition qu'ils survivent, deviendront des adultes, mais généralement, ils n'auront pas eux les yeux colorés. Ce sont des mosaïques, seules certaines de leurs cellules ont intégrés le transgène et on a visé surtout leur lignée germinale. Donc, les survivants qui auront généralement les yeux blancs, doivent être croisés (individuellement !) avec des mouches w-.
    Et parmi leurs descendants, (F1) on aura peut-être la chance de trouver quelques individus transgéniques avec les yeux colorés. Cela voudra dire que l'élément p a bien transposé dans la lignée germinale de la droso injectée et qu'une cellule germinale transgénique de cette droso a participé à une fécondation pour donner cet individu aux yeux colorés.
    Il reste à récupérer précieusement ces individus aux yeux colorés, et les croiser individuellement avec des w- pour amplifier le transgène, on croisera ensuite des individus de cette lignée avec d'autres souches pour déterminer sur quel chromosome se trouve le transgène.
    Je précise qu'il faut injecter au départ quelques centaines d'embryons, car si l'expérience a bien marché, tu obtiendras des transgéniques dans 10 à 20% des cas. Environ 80 à 90% des embryons injectés ne donneront rien. Et si les conditions d'injection et de survie des embryons ne sont pas optimales, ça peut être beaucoup moins que ça.

    A part ça, oui, on utilise bien du x-gal pour révéler l'activité beta-gal...

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