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Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN



  1. #1
    MuAkrem

    Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN


    ------

    Je sais que suite à l'incorporation des plasmides on aura trois cas de figures:
    (-)des bactéries qui n'ont rien incorporé donc seront sensibles aux deux antibiotiques ampicillin et tetracycline
    (-)des bactéries qui ont incorporé le plasmide recombiné donc seront sensibles au tetracycline et resistant à l'ampicillin
    (-)des bactéries qui ont incorporé le plasmide intact donc seront résistants aux deux antibiotiques
    J'ai aussi compris que la sélection à la base de l'ampicillin va nous permettre de distinguer entre bactéries qui n'ont rien incorporé et bactéries qui ont incorporé un plasmide et la tetracycline va nous permettre de distinguer entre plasmide recombiné et non recombiné.
    Ma question est la suivante: la selection à la base de la tetracycline ne va-t-elle pas tuer les bactéries ayant incorporé le plasmide qui porte l'ADN dont on a besoin?
    Je vous pris de m'aider à trouver (si elle existe) l'erreur dans cet enchainement. Merci,

    -----

  2. #2
    dalmia

    Re : Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN

    Bonjour !
    Avant toute réponse, je me permet de signaler trois choses ne vont pas dans ton post. La première est de commencer par une salutation quelconque, quand même...

    Sinon, il faut que tu places ton contexte, tu es trop la tête dans le guidon. Présente-nous un minimum de protocole, de but de manip. "Des plasmides" : combien ? Deux ? Un avec un gène de résistance pour Tet et l'autre avec un gène de résistance pour Amp ? Sois précis ! Le site d'accueil du transgène est à l'intérieur du gène de résistance pour la Tet, c'est ça ?

    Le vocabulaire que tu utilises n'est pas le bon. On ne parle pas d'incorporation mais de transformation (même si on comprend le sens). La bactérie est transformée par un plasmide. "Plasmide intact" : ça ne veut pas dire grand chose, là il faut parler de plasmide non recombiné.

    A bientôt,
    Dalmia

  3. #3
    MuAkrem

    Re : Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN

    Bonjour,
    Je suis désolé de ne pas avoir respecté les netiquettes, j'avoue il y a trop d'ambiguité faute de temps,
    *Bref, le contexte est le suivant: on veut cloner un gène de l'ADN humain, pour ceci on utilise les plasmides des bactéries d'E.Coli qui contiennent entre autres des gènes de résistance à la tetracycline et l'ampicilline, grâce aux enzymes de restriction on peut incorporer le gène humain qu'on veut cloner dans le plasmide à un emplacement entre les séquences du gène qui code pour la résistance à la tetracycline.
    *Après culture, on aura trois cas que j'ai mentionné dans ma premiere publication.
    *J'espère que j'ai pu m'exprimé,
    *Merci,

  4. #4
    Fraggle Rock

    Re : Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN

    Bonjour,

    à mon avis, il reste encore une ambigüité dans ton énoncé. En fait, il s'agit d'un seul et unique plasmide qui porte les 2 gènes de résistance aux antibio. N'est-ce pas ? Effectivement ce point là n'est pas très clair.
    Si c'est bien ça : tu as raison, en clonant ton gène dans le gène TetR, tu l'innactives donc, si tu mets les bactéries en présence de tétracycline, tu vas les tuer et tu n'auras pas ton clonage.
    Le principe dans ces cas là est de faire une réplique :
    tu sélectionnes d'abord les transformants sur ampicilline, puis, à l'aide d'un tampon de velours, tu répliques les clones de la boîtes ampi sur une boîte contenant de la tétracycline. Ceux qui poussent ont le plasmide sans le gène d'intérêt. Ceux qui ne poussent pas ont le plasmide, mais leur gène TetR est inactivé et donc le gène est potentiellement inséré dedans. Reste à repérer les clones en question sur la première boîte et à les amplifier, avant de vérifier qu'on a bien le gène d'intérêt dans le plasmide (par un coup de séquence par exemple...)

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