Fabrication banque ADNc

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Bonjour,

lors des étapes de fabrication d'une banque d'ADNc par la technique à la nucléase S1, il y a quelque chose qui me chiffone.

Après action de la reverse transcriptase, puis traitement alcalin pour détruire l'ARNm matrice, on se retrouve avec un simple brin d'ADNc.
Celui ci forme une boucle en épingle à cheveux, ce qui forme donc un extrémité double brin, servant de matrice à une ADNpolymérase ADN dépendant, la T4 DNApolymérase.

On reconstruit ainsi un ADNc double brin, puis on digère avec la nucléase S1 pour obtenir une extrémité franche.
Voila pour le principe.

Ce qui me gène c'est la formation d'une boucle en épingle à cheveux. Cela doit se former si il y a une séquence palindromique à l'extrémité 5' de notre ADNc, non?

Il y a t il toujours de telle séquence dans les séquence d'ADNc, et toujours a l'extrémité 5'?
N y a t il pas un risque qu'une telle boucle se forme au milieu de notre séquence codante? Ou au contraire ne se forme t elle pas?...

Si quelqu'un a une idée, c'a m'intéresserait.

Merci
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[Didie13]

Cela doit se former si il y a une séquence palindromique à l'extrémité 5' de notre ADNc, non?

Pourquoi devrait-il forcement y avoir une séquence palindromique pour que deux séquences se complémentarisent?

C'est après action de la nucléase S1 qu'on ajoute (à l'ADNc) deux sites de restrictions spécifiques du plasmide dans lequel on veut introduire l'ADNc...

Pour ta question sur le irsque je ne sais pas...mais c'est intéressant.

[mantOs]

Il faut savoir aussi que la RT s'arrete souvent sans finir de retrotranscrire l'ARNm donc bon il doit y avoir apparition de ces boucles un peu n'importe où .

A confirmer.


Cordialement
Paul

[invitec24e6cfc]

Bonjour a tous,

Technique à la nucléase S1

Pour la synthèse du premier brin, on utilise une reverse transcriptase (ADN polymérase ARN
dépendante). Comme pour toutes les ADN polymérases, on a besoin d’une amorce pour initier la
polymérisation. On utilise un oligonucléotide polydT qui s’hybride sur toutes les queues polyA de
tous les ARN messagers polyA+. Après la synthèse du brin complémentaire, on détruit les ARN de
ces hétéroduplexes par un traitement alcalin (NaOH). L’extrémité 3' de l'ADN obtenu peut s'hybrider
sur lui-même en formant une boucle en épingle à cheveux. La position de cette hybridation est
totalement inconnue et va conditionner la taille de l’ADNc final. La formation de cette épingle
génère une extrémité double brin qui peut servir d'amorce à une ADN polymérase -ADN dépendante.
Cette activité enzymatique va permettre d’obtenir un ADNc double brin avec une épingle à cheveux
correspondant à l’extrémité 5’ de l’ARN initial. Une telle structure ne peut pas être intégrée dans un
vecteur et elle va être transformée en extrémité franche en faisant agir une nucléase dégradant le
simple brin, la nucléase S1. Il est important de noter que cette technique implique obligatoirement la
perte d’une partie du cDNA correspondant à l’extrémité 5’ de l’ARN et dont l’étendue est inconnue.
Note : l’ADN polymérase n’est pas indispensable pour la synthèse du second brin de l’ADNc. En
effet la reverse transcriptase peut synthétiser de l’ADN à partir d’une amorce ADN, toutefois cette
activité n’est souvent pas suffisante.

[A voir en vidéo sur Futura]