ARN-ADNc

[invite2406a0a9]

Bonsoir,
Juste une petite question : en partant d'une quantité bien définie d'ARN, combien obtient-on d'ADNc après une étape de RT : 2 fois plus, la même quantité ou autre...... Je considère, bien sûr que la réaction est totale.
Merci.
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[piwi]

ca doit dépendre de ton activité enzymatique. M'enfin normalement y a pas de raison que tu en ais moins que d'ARN. Tu dois en avoir plus.
l'enzyme ne fonctionne pas qu'une fois. Une fois qu'elle a fini son boulot elle se trouve un nouvel RNA de libre et c'est reparti!

Maintenant ce qui sera limitant ca sera ta concentration en nucléotide dans le jus. (sais plus si il faut de l'ATP pour cette reaction. Je crois que oui alors ca sera aussi limitant)

[Neutrino]

Il faut des desoxy-nucléosides triphosphates des 4 genres :
dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
Si la RT est bien faite, ils sont LARGEMENT en excès.

Après un seul cycle de RT, j'aurais tendance à dire qu'il y a autant de ADNc double brin que d'ARN. Mais je ne sais pas si la notion d'"étape" correspond à celle de cycle!

[invite2406a0a9]

En effet, si les conditions sont optimales : RT en pleine forme et un paquet de dNTP dans la sauce.

j'aurais tendance à dire qu'il y a autant de ADNc double brin que d'ARN

En fait c'est bien ça mon problème : à partir d'un ARN je vais former un hybride ARN-ADNc.
Mais si on chiffre ce qui se passe. Si je pars de 10 ng d'ARN, j'obtiens combien d'ADNc après mon étape (cycle) de RT ? 10 ou 20 ng ? (RT totale, non spécifique d'un gène)

[A voir en vidéo sur Futura]

[Neutrino]

Il me semble que la Reverse Transcriptase effectue également la synthèse d'un brin complémentaire d'ADN, et ne laisse pas en place un hybride ARN/ADN.
Dans ce cas là, en paire de base, ADN=ARN, mais en masse, ADN = 2 ARN car l'ADN a la même séquence mais en double brin.

Je me dis ça parce que le VIH par exemple intègre bien un ADN double brin dans le génome de l'hote...

Quelqu'un pourrait répondre?

[invite2406a0a9]

La RT du VIH est particulière.
Concernant l'activité ADN polymérase ADN dépendante des RT de bio mol.....je ne sais pas. Mais je pense que c'est plutôt la Taq polymérase qui fait ça......

[Yoyo]

Bonsoir,

En effet les RT n'ont a priori pas d'activite ADN polymerase, ADN dépendant. Deplus les RT non modifiée possede une activité RNAse H qui va degrader le brin d'ADN en duplexe avec l'ARN.
Ainsi apres une RT tu ne peux pas reverse transcrire plusieurs fois la meme molécule d'ARN.

Donc si tout est optimal tu obtiendras le meme nombre de molécules d'ADN que tu avais de molécules d'ARN. maintenant au niveau masse, il y a de subtile differences entre ADN et ARN, donc a partir de 10ng d'ARN tu n'obtiendras 10ng d'ADN mais un peu plus ou moins (faudrait savoir si U est > ou < a T, les dNTP et les rNTP ayant un O de différence.)

Yoyo

[invite2406a0a9]

Ben, encore une fois, merci.

[invite8bba7507]

Il faut chauffer pour dissocier l'ARN de l'ADNc, si je ne m'abuse... D'où l'utilisation de la Taq polymérase : Thermophilus, résiste au chaud... Pas de chauffage, pas de dissociation (enfin, i' me semble)

[invite2406a0a9]

Il faut chauffer pour dissocier l'ARN de l'ADNc,

C'est ce que je pensais, or vu que pour mon étape de RT je ne chauffe pas (je fais qu'une élongation à 37°C), je considerais que j'avais un hybride ARN-ADNc. Je ne savais pas que les RT avaient une activité RNAse H. L'ARN hybridé à l'ADNc est donc dégradé.