amplification de l'ADN

[invitef474573a]

Bonjour,
j'aurais besoin de quelques eclaircissements a propos de la methode de duplication de l'ADN (Mullis). Desole je ne suis vraiment pas cale dans ce domaine, alors mon vocabulaire va etre un peu bancal.
Il est stipule que l'ADN-polymerase a besoin d'amorces en bout de sequence pour pouvoir la dupliquer. Cette amorce doit correspondre exactement avec le debut (ou fin) du brin d'ADN que l'on veut dupliquer...
Question fondamentale: pourquoi avoir besoin d'une amorce? et Comment peut on trouver la bonne sequence correspondante (qui apparement est une sequence de 20 nucleotides environ)(c'est pire que de jouer au loto, pour moi )?
bref, pourquoi ne peut on pas ajouter une amorce que l'on connait au brin d'ADN et qui permet la transcription du brin d'ADN concerne?

ben, j'espere que je n'ai pas ete trop flou...
Merci pour vos reponses
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[Gnurf]

Salut !
Je crois que tu mélanges deux trucs differents : l'adn polymérase qui duplique un simple brin en entier, et l'arn polymérase qui en copie une partie pour pouvoir la traduire ensuite en protéine. Precise donc ta question.
Pourquoi une amorce ? Parce que si l'arn polymérase se fixait n'importe où et dans n'importe quel sens elle copirait n'importe quoi et on perdrait beaucoup d'énergie pour rien.
Pour ce qui est du "loto", oui s'en est un mais tu joues avec des millions de tickets !!! en effet il n'y a pas qu'une polymérase par cellule et les facteurs de duplication ne sont pas non plus en exemplaire unique.
Pour ta dernière question, je suppose que tu parles d'une experience in vitro et en effet on peut influencer la transcription de l'adn non pas en ajoutant une amorce mais des "facteurs de transcriptions" qui contrôlent quel gène est transcrit et à quelle fréquence.
J'éspère avoir été clair et correct.

[invite9cd78264]

Il est stipule que l'ADN-polymerase a besoin d'amorces en bout de sequence pour pouvoir la dupliquer. Cette amorce doit correspondre exactement avec le debut (ou fin) du brin d'ADN que l'on veut dupliquer...
Question fondamentale: pourquoi avoir besoin d'une amorce? et Comment peut on trouver la bonne sequence correspondante (qui apparement est une sequence de 20 nucleotides environ)(c'est pire que de jouer au loto, pour moi )?
bref, pourquoi ne peut on pas ajouter une amorce que l'on connait au brin d'ADN et qui permet la transcription du brin d'ADN concerne?

Salut

Cette méthode est appelée PCR (Polymerase Chain Reaction).
Voici un site où c'est très bien expliqué avec des animations.
http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/pri...esentation.htm

L'amorce sert de point de départ pour la réplication. Et effectivement on connait sa séquence : quand tu fais de la PCR tu connais la séquence du fragment d'ADN que tu veux amplifier, et c'est toi qui choisis les amorces et tu peux les faire synthétiser.

Voila j'espère que c'est plus clair.

Cissou

[invitef474573a]

merci pour les corrections...et le site vraiment sympa

mais je pose une question apres ca. Dans le cas de la duplication PRC, donc duplication d'une sequence determinee, quand vous dites:

"on peut influencer la transcription de l'adn non pas en ajoutant une amorce mais des "facteurs de transcriptions" qui contrôlent quel gène est transcrit et à quelle fréquence."

est ce que ca revient a dire que l'on peut 'rallonger' comme on veut une sequence, que l'on peut a volonte 'faire un collier sur mesure' de sequences (genes ou autre?), separees par les informations utiles aux enzymes qui 'collent' les genes (euh, je crois que c les transposases ou alors ligases...suppose que la differnece est la meme en adn ou arn polymerase...)???

desole si c une grosse betise

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite9cd78264]

mais je pose une question apres ca. Dans le cas de la duplication PRC, donc duplication d'une sequence determinee, quand vous dites:

"on peut influencer la transcription de l'adn non pas en ajoutant une amorce mais des "facteurs de transcriptions" qui contrôlent quel gène est transcrit et à quelle fréquence."

est ce que ca revient a dire que l'on peut 'rallonger' comme on veut une sequence, que l'on peut a volonte 'faire un collier sur mesure' de sequences (genes ou autre?), separees par les informations utiles aux enzymes qui 'collent' les genes (euh, je crois que c les transposases ou alors ligases...suppose que la differnece est la meme en adn ou arn polymerase...)???

Il y a confusion entre ce qui se passe in vitro pendant une manip de PCR, et in vivo dans une cellule (confusion amenée par Gnurf qui n'avait pas bien compris ta question je crois )

Quand tu fais une PCR, l'enzyme qui permet la réplication est la Taq polymérase, et tu obtiens des fragments de taille constante qui correspondent à la séquence de ta matrice entre les deux amorces.

Dans une cellule, les facteurs de transcription sont des protéines qui se fixent à l'ADN sur des séquences spécifiques (séquences régulatrices), et vont permettrent à leurs gènes cibles de s'exprimer ou non. Ca marche dans les deux sens.
Ces facteurs permettent de controler l'expression des gènes, ce qui est primordial. Ex farfelu : des cellules épidermiques qui sécrètent des sucs gastriques ça fait désordre. Donc certains gènes doivent s'exprimer seulement dans certains types cellulaires, ou alors seulement à certains moments.

Par contre, ça n'influe pas sur la longueur de la séquence des gènes, ni sur leur disposition (j'ai pas tout suivi ce que tu disais).

Et pour finir :
ADNpolymérase =>synthèse d'ADN = réplication
ARNpolymérase =>synthèse d'ARN = transcription


Voila, n'hésite pas si j'ai pas répondu à toutes tes questions

Cissou

[invitef474573a]

euh...je ne savais pas tout ça...mais en fait ma question est beaucoup trop evasive , je pense...

voila, prenons la PRC. j'ai une sequence d'ADN que je veux dupliquer. La methode dit: trouver la bonne amorce, ajouter la TAq, laissez la travailler, et le tour est joue.
moi, je veux savoir si, au moment de l'ajout de l'amorce, c'est possible de lier au bout de la sequence une suite de nucleotides qui auraient la meme fonction qu'une amorce...cela reviendrait a coller une suite de nucleotides a un brin d'ADN deja coupe. Etant donne que , in vivo, il existe des enzymes qui ont les proprietes de couper et coller des genes ou suites de nucleotides, je me demande si je peux les utiliser pour enchainer des bouts d'ADN...je ne pose pas la question de l'expression des genes, je suis plutot chimiste a la base

voila...enieme tentative de me faire comprendre! si vous me trouvez lourd, je comprendrai

[invite9cd78264]

Si on reste dans le cadre de la PCR, la séquence d'ADN que tu as au départ sert de matrice et le brin synthétisé est complémentaire. Les amorces sont elles-mêmes complémentaires au brin matrice.
Donc la Taq "recopie" le brin pour synthétiser de l'ADN complémentaire (ça se voit bien sur les schémas du site).

Après, il est possible de synthétiser de l'ADN de novo en rallongeant une chaine (enfin je pense ). Ca doit être comme ça que sont faites les amorces justement. Mais là on ne parle plus de PCR, ou d'amplification d'ADN.

Et oui, il est également possible de faire des "couper/coller" de bouts d'ADN avec des enzymes de restriction. C'est comme ça qu'on fait des vecteurs pour transfecter des gènes dans des cellules. Mais c'est pas non plus de la PCR et on se sert pas d'amorces.

J'ai compris ce coup-ci ?

[invitef474573a]

Après, il est possible de synthétiser de l'ADN de novo en rallongeant une chaine (enfin je pense ). Ca doit être comme ça que sont faites les amorces justement. Mais là on ne parle plus de PCR, ou d'amplification d'ADN.

ah ah! la, ca m'interesse! c'est bien de rallonger UNE chaine que je me pose la question. mais on peut le faire deux manieres?!? du couper-coller avec des oligomeres (ou amorces par ex- suite de 20 nucleotides) ou d'ajouter les nucleotides un par par...et la, j'en perds mon latin! koi ke je dois prendre comme enzymes? y a t-il des sequences de nucleotides specifiques et necessaires a incorporer pour rendre le 'raccord' en ancien ADN et chaines nouvelles?

Et oui, il est également possible de faire des "couper/coller" de bouts d'ADN avec des enzymes de restriction. C'est comme ça qu'on fait des vecteurs pour transfecter des gènes dans des cellules. Mais c'est pas non plus de la PCR et on se sert pas d'amorces.

euh la , tu m'as peu perdu..."vecteurs", "transfecter"...je vais me documenter.

mais pour faire simple, disons que je suis en in vitro!
euh, p't etre que je peux chercher encore des infos et voir les differents mecanismes, mais moi et la bio, ca fait longtemps...

Merci deja pour tout ca !

[invitee8b3f97e]

Un vague souvenir me revient sur la synthèse d'ADN de novo, mais il faudra absolument confirmer.

Il me semble que dans certaines conditions (Température, pH, enzymes...), les nucléotides se lient spontanément entre eux. Donc il est possible de fabriquer de courtes chaines d'ADN sans matrice de référence. Pour obtenir l'alignement souhaité on fait défiler dans la solution la séquence que l'on souhaite : une forte concentration de A, puis on change la solution pour une autre avec une forte concentration de C, etc etc...

A vérifier

[invited8287251]

pour synthetiser des amorces on utilise un synthétiseur d'oligonucléotides (maintenant on les commande à façon, (c'est pas cher).`

Voici le principe de la reac. chimique : http://www.bio.davidson.edu/Courses/..._synthesis.htm

[invitee8b3f97e]

Ouais, j'étais pas très loin.

Merci beaucoup pour les explications.