Problèmes: Recombinaison d'un plasmide

[Pilis]

Salut à tous !

Avant de commencer, je tiens à préciser aux plus pointilleux qui critiquerons le titre de ce forum ; je n'avais pas d'autre idée..
merci ^^

Du coup commençons, j'ai deux problèmes de bio moléculaire et je bloque, si quelqu'un aurait l'amabilité de m'aider ;

énoncé 1:

Lorsqu'on incorpore un gène dans un plasmide disponible dans le commerce, on aimerait insérer le moins d'ADN supplémentaire possible en plus du gène réel avec son promoteur. Parfois, cependant, il n'y a pas de séquence de restriction appropriée dans la région avant et après le gène qui peut également être trouvé dans le plasmide.

Décrire une variante de la PCR, avec laquelle on peut ajouter une telle séquence de restriction avant et après le gène à insérer à n'importe quelle position.

Donc voila je suis complètement perdu.


énoncé 2:

Lorsqu'on rajoute une séquence à un plasmide (à l'aide d'un PCR), cette nouvelle séquence à 50% de chance d'être bien placé et 50% d'être inversé. (cf. photo)

Proposez une méthode pour que ce rendement soit de 100% (pour qu'il y'ait toujours des plasmides avec la séquence dans le bon sens).

je pense que c'est assez facile mais je bloque.

Merci de votre compréhension à tous !
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[YB17]

Salut.

Si il n'y a pas de site de restriction utilisable encadrant ton gène, il va falloir en ajouter. On va donc ajouter 2 sites de restrictions différents de chaque côté de ton gène. Note que pour l'énoncé 1 tu peux utiliser 2 fois la même séquence de restriction car comme tu as déjà ton promoteur le sens d'insertion du gène n'a pas d'importance. En utilisant 2 sites différents tu répondras à l'énoncé 2 en même temps.
Il faut que tu amplifies ta séquence par PCR en choisissant bien tes amorces. Il faut qu'elles soient complémentaires aux extrémités de ta séquences avec en plus une courte séquences qui ne correspondent pas à ton gène mais qui contiennent une séquence de restriction (on ajoute généralement quelques bases supplémentaires qui ne correspondent à rien et qui vont permettre à l'enzyme de bien se poser sur tes fragment lors de la digestion.
Ainsi tu peux choisir comme amorce :
NNNN-EcoR1-début de ta séquence
fin de ta sequence-HindIII-NNNN
Une fois ta PCR faite, tu digères tes fragments avec les 2 enzymes et pareils avec ton plasmide. Quand tu choisis tes sites il faut que tu vérifies l'ordre dans lequel les sites de restriction sont présents sur le plasmide. Dans notre cas, il faut que EcoR1 soit avant HindIII et le tout après le promoteur déjà présent sur le plasmide (sinon ton insertion se fera à l envers). Donc il faut que ton plasmide ait :

Promoteur-EcoR1-NNNNN-HindIII-TATAA

Une fois le tout digéré et ligué ensemble tu auras

Promoteur-EcoR1-début du gène-...gène...-fin du gène-HindIII-TATAA (100% dans le bon sens)

[YB17]

Désolé j'ai écrit trop vite, dans mon texte il faut évidemment remplacer TATAA par STOP ...

[Pilis]

Aaaah d'accord ! Merci

Mais ce que tu appelles NNNN c'est les quelques bases supplémentaires qui ne correspondent à rien ?

Merci de votre compréhension !

[A voir en vidéo sur Futura]

[YB17]

Oui c'est ça. Par convention on utilise "N" pour signifier que cela peut-être n'importe quelle base. Ici j'ai mis 4N à côté des sites de restrictions mais cela peut varier suivant l'enzyme que tu utilises. Dans ton cas, ce n'est pas important je pense.
Je précise que j'ai mis aussi des N dans : Promoteur-EcoR1-NNNNN-HindIII-TATAA mais cela n'a aucun rapport avec les N de tes amorces (NNNN-EcoR1-début de ta séquence et
fin de ta sequence-HindIII-NNNN), ceux ci désignent des bases qui peuvent éventuellement séparés les 2 sites de restriction sur ton plasmide qui ne sont pas forcément côte à côte.
Je précise aussi que les N que tu ajoutes en faisant ta PCR vont être éliminés lors de la digestion enzymatique.

[Pilis]

Ah ok merci.

Maintenant tous ceci est tout-à-fait clair !
Je vous remercie beaucoup.
Et je pense que le sujet est maintenant résolu.

Sujet résolu