Bonjour,
J'aimerai comprendre quelle est l'utilité de la PCR (Polymerisation Chain Reaction)... Je comprend bien qu'on va pouvoir avoir des millions de copies d'une même séquence d'ADN.... Et après ?
On se retrouve avec un million de séquences identiques, en quoi cela nous aide-t-il en médecine pour le diagnostic de mutations par exemple ?
Merci !
La PCR permet d'amplifier certaines séquences bien précises. Si par exemple on prélève du sang à quelqu'un et qu'on en extrait l'ADN, cet ADN appartient potentiellement à plusieurs individus: l'humain qu'on a prélevé ainsi que des parasites éventuels circulant dans son sang. Si on veut savoir si cet individu est porteur d'un virus du sang, on va utiliser des amorces spécifiques d'une séquence du virus en question, et la PCR amplifiera cette séquence et cette séquence seulement, au détriment de tout le reste de l'ADN, qui était beaucoup plus abondant au départ (puisque le génome humain est beaucoup plus long que celui du virus). Sans amplification on ne pourrait pas détecter l'ADN viral qui est en concentration trop faible (enfin ça change, maintenant je crois qu'on peut le faire).
Faire une PCR avant de faire séquencer ton échantillon te permet d'une part de séparer précisément la région d'intérêt du reste du génome (par électrophorèse), ce que tu ne peux pas faire sans l'amplifier.
Ensuite si ton échantillon n'est pas assez concentré en ADN à séquencer tu ne pourras pas le séquencer de manière fiable, d'une part parce que les séquenceurs utilisés en routine pour ce genre de manip ont un certain seuil de détection et qu'une seule molécule ne suffit pas, et d'autre part parce que tu veux que ta molécule soit séquencée plusieurs fois pour avoir une certaine profondeur de séquençage te permettant d'affirmer que la séquence que tu as est bien celle que tu avais dans ton échantillon au départ.
En effet la Taq Polymerase que tu utilises pour la PCR peut faire des erreurs, et le séquenceur peut aussi faire des erreurs, que tu vas en quelque sorte "noyer" en séquençant plein de copies de ton ADN d'intérêt.
Bonsoir,
La PCR a deux grandes utilités, pour schématiser.
D'abord, elle peut être une fin en soit, càd que le résultat de la PCR permet de poser un diagnostic qualitatif. Une personne est malade, on suspecte la bactérie X dans le LCR par exemple : on fait une PCR qui vise à détecter l'ADN de la bactérie X. Si rien n'a été amplifié, c'est que la bactérie n'est pas là (la personne est malade à cause d'autre chose !). Si tu constates que de l'ADN a été amplifié, c'est que la bactérie X est bien là, et tu peux proposer une antibiothérapie par exemple. C'est donc sur présence/absence de pathogène, en gros.
On peut aussi poser un diagnostic de mutation comme il a déjà été expliqué plus haut : selon comment tu fais ta manip, l'amplification va témoigner ou non de la présence de la mutation cherchée.
Un peu plus subtil : on peut aussi mettre en évidence une mutation non pas juste sur amplification ou pas, mais sur la longueur de l'ADN amplifié : par exemple, ton produit PCR d'un ADN normal serait de 150 pb alors que celui d'un ADN muté serait de 120 pb, et ça tu peux le voir sur gel d'électrophorèse.
Sinon, la PCR peut être une étape nécessaire au diagnostic et le but est bien d'obtenir un grand nombre de fragments d'ADN pour ensuite le séquencer par exemple, et là c'est le séquençage qui répond à ta question, pas la PCR elle-même qui n'a été qu'un outil d'amplification.
Dalmia
Merci beaucoup pour vos réponses.
Je comprend maintenant que la PCR est avant tout un outil pour amplifier l'ADN. Cependant, il semble évident qu'il soit nécessaire de connaître la séquence de la mutation recherchée pour utiliser des amorces adaptées.
Dans ce cas, à quoi sert concrètement le séquençage par la suite (Méthode de Sanger notamment) ? Si on connaît déjà la séquence de la mutation lors de la PCR, quel interet de rechercher cette séquence à l'aide des didésoxynucléosides et tout le reste ??
Merci de prendre de votre temps pour me répondre
Hello,
Alors non, tu n'es pas obligé de connaître "la séquence de la mutation" que tu recherches, car tu peux choisir des amorces qui encadrent le locus de la mutation. Tu amplifies, tu séquences et tu regardes ensuite si la séquence est anormale, et si oui quelle est la nature de la mutation.
Prenons le cas de la mucoviscidose. C'est une maladie génétique due à une mutation dans un gène codant pour la protéine CFTR. La mutation la plus fréquente est une délétion (ΔF508), il manque un acide aminé. Mais il existe aussi des mutations faux-sens, non-sens, des insertions, etc. Seul un séquençage du gène cftr amplifié te permettra de le savoir.
Dalmia
