Détection bactériennes

[shyroki]

Voici ma problématique, je cherche le moyen de détecter 1 à 10 bactérie par mL, mettre au point un test du genre (présence ou absence), peut importe la souche Gram + ou Gram -
De façon relativement rapide donc sans passer une étape de culture.

L'approche anti-corp arrive à ce genre de sensibilité mais je suis spécifique à une seul souche.

Si quelqu'un a une idée je suis preneur ?

Sinon j'avais pensé à la PCR, certain luttent contre toutes contamination bactérienne pour ne pas être pollué, hors c'est justement ça que je voudrais mettre en évidence.
Est-ce que quelqu'un connait bien la problématique des contaminations bactérienne dans les PCR (ou autres) et qu'elle type de sensibilité je peu espérer si mon but est la mise en évidence des bactéries ?

Par exemple si je laisse pendant 1H le plasmide puc19 à 37°C dans du PBS avec 10 CFU d'une bactérie X ou Y dans 1mL, est-ce que je peu voir quelques chose en PCR ou en migration sur gel ?
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[FARfadet00]

Bonjour,

je ne suis pas sûr de comprendre ce que vous recherchez. Corrigez-moi si je dis une bêtise : vous voudriez un technique qui permette de détecter et d'identifier n'importe quelle espèce bactérienne, et ce plus rapidement qu'une culture.

Si c'est bien ça, je ne crois pas que ça existe. Même passer par une étape de culture n'est pas la solution : ça ne vous permet pas de détecter les bactéries viables non cultivables (VNC). La solution que je vois c'est de passer par l'ARN 16S :

1. Extraction de l'ADN de l'échantillon (il existe des kits pour ça)
2. Amplification du gène de l'ARN 16S par PCR
3. Séquençage du produit de PCR
4. Comparaison avec les bases de données pour identifier les espèces en présence (ou les OTU, du moins)

Ce n'est donc pas extrêmement rapide ... d'autant moins rapide que le séquençage est souvent sous-traité à d'autres labos et il peut y avoir quelques délais.

Pour les quelques analyses 16S qu'il m'est arrivé de faire, je n'ai pas été contaminé pendant la PCR.

Cordialement

[shyroki]

Non je ne cherche pas à "identifier" l'espèce, juste savoir si elles sont présente ou non, morte ou vivante peu importe.
J'ai effectivement pensé à l'ARN 16S, mais les quantités en bactérie pour cela doivent être bien supérieur à 10 CFU /mL

Là je me penche sur l'activité des enzymes de restriction issue de 10 bactéries, une activité enzymatique peu trahir leur présence et la PCR est un moyen d’amplifier le signal.

Je me tourne donc vers des gens qui maitrise bien mieux la PCR que moi et qui rencontre des problèmes de contamination pour leur manip.

Après si certain maitrise l'activité enzymatique, une idée d'enzyme suffisamment puissante pour être mit facilement en évidence et présent chez presque toutes les bactéries ?

[Flyingbike]

Les enzymes de restriction ne sont pas universelles et différent entre les espèces
Je ne vois pas mieux que la PCR 16s qui est théoriquement assez sensible
En option 2, l’ATPmetrie mais ça sera que pour les vivantes

[A voir en vidéo sur Futura]

[shyroki]

Pour les enzymes de restriction c'est juste une idée.

Peut importe l'enzyme qui va couper l'ADN ou l'ARN, le but étant de détecter un ADN ou ARN coupé qui trahirait la présence de bactérie.

Merci pour l'ATPmetrie que je ne connaissais pas, mais visiblement 1pg ATP ≈ 1 000 bactéries, j'ai regardé un kit et il va de 4 à 2x106
pg ATP/mL , donc de 4x10^3 à 2x10^9 bactéries (une sensibilité 3 log supérieur)

La PCR 16S est pas mal, mais les seuils de détection sont de l'ordre de 1x10^2 et surtout 48H de manip

[minushabens]

une bactérie par millilitre c'est très peu. Avec toutes les méthodes connues tu vas être dans le bruit de fond. La PCR par exemple amplifie toujours quelque-chose dans les témoins négatifs. Il y a de l'ADN bactérien dans la taq, c'est connu et publié. Il te faudrait concentrer tes échantillons.

[Flyingbike]

En 16s il n’y en a pas pour 48h

Et en pcr on peut bosser sur cellule unique, donc niveau sensibilité je ne pense pas qu’on fasse mieux.