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extraction ADN




  1. #1
    july123

    extraction ADN

    Bonjour,

    je fait de l'extraction d'ADN avec TE, lysozyme, SDS, isopropanol et éthanol mais j'obtiens un ADN pas très propre (<1 au spectro). on m'a dit de rajouter une étape avec le chloroforme mais celui nécessite une hotte chimique ce qu'on a pas. je voulais donc savoir par quoi on pourrai le remplacer. ( les kits d'extraction d'ADN étant trop cher on voudrais trouver une alternative)

    MERCI

    -----


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  3. #2
    Jean-Luc P

    Re : extraction ADN

    Tu dois faire ce protocole, je pense :
    http://aroianlab.ucsd.edu/protocols/rapid-miniprep.htm

    Sincèrement il est difficile à améliorer sauf extraction au phénol:chlroforme:acide isoamylique

    par contre tu as un autre protocole, pas cher et inspiré des kits : la lyse alcaline, l'idée étant de récupérer du tampon P1 en trop dans les kits de midiprep ou maxiprep :

    * resuspendre le culot de 1,5 ml de E coli dans 100 microlitres de P1 ou T1
    * ajouter 200 microlitres de (200 mM NaOH ou KOH 1%SDS w/v) bien mélanger par retournements (4-5)
    * incuber 3-4 min à température ambiante
    * neutraliser avec 150 microlitres de (3M Kacetate pH 5.5) froid, bien mélanger par reournement (5 fois) puis centrifuger aussitôt à 13.000 g pendant 10 min à 4°C
    * prélever le surnageant qui contient l'ADN plasmidique
    * (pour améliorer la pureté de l'ADN recentriger 5-10 min et reprélever le surnageant)
    * précipiter l'ADN en ajoutant 1 ml d'éthanol absolu froid (conservé au congélateur) - mélanger par retournement
    * centrifuger 10 min - l'ADN précipite
    * (laver le culot avec 1 ml d'EtOH à 70°C)
    * sécher et reprendre dans l'eau ou le TE (20 à 50 microlitres)
    Jean-Luc
    La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
    Salvor Hardin

  4. #3
    july123

    Re : extraction ADN

    Ok Merci

    ça implique qu'il faut acheter quand même des kits car on ne sait pas ce qu'est le tampon P1.


  5. #4
    gorben

    Re : extraction ADN

    Salut,

    tu peux aussi degrader tes proteines par des enzymes.

    Sinon, tu as toujours la methode au Clorure de cesium, mais ca implique d'avoir une ultracentri...

    voir :
    http://enslyon.free.fr/rapports/biol...c_Norais_1.pdf
    http://podospora.igmors.u-psud.fr/me...r.html#extract

    L'interet du ClCs, c'est que tu peux separer les proteines, l'ARN, l'ADNg et l'ADNm ou l'ADNp

    A+

    PS : sur le site de QIAGEN, tu as dans les proto du kit maxiprep la composition des tampons.

  6. #5
    Jean-Luc P

    Re : extraction ADN

    Citation Envoyé par july123
    Ok Merci

    ça implique qu'il faut acheter quand même des kits car on ne sait pas ce qu'est le tampon P1.
    P1
    50 mM Tris-Cl pH 8.0
    10 mM EDTA
    100 microgrammes/microlitre RNAse A

    conserver à 4°C pour la RNAse
    Jean-Luc
    La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
    Salvor Hardin

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    BILILA

    Re : extraction ADN

    bonjour
    pourquoi pas utilisé la solution chelex pour l'extaction de l'ADN c'est facile peu couteux sinon la solution de biorad instagene matrix .

  9. #7
    Elendilmir

    Re : extraction ADN

    Ton extraction d'ADN, c'est plus par minipreps ou par midipreps, j'ai un protocole un peu alternatif pour faire des minipreps, mais je ne sais pas si c'est ca que tu cherches.

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