Extraction et purification ADN végétal

[invited3919533]

Bonjour tout le monde,
J'ai réalisé une extraction et une purification de l'adn végétal, en suivant tout simplement un protocol au cours.
N'ayant aucune explication du rôle des solutions utilisées dans la manip, j'ai deux trois question à vous poser
Tout d'abord en début de manip j'ai du placer mon microtube 2 heures au bain marie à 65°C j'aimerais savoir quel est l'interet de faire ça ?
Ensuite beaucoup plus loin dans la manip j'ai utilisé un tampon Murray-Thompson (éthanol absolu + acétate d'amonium + eau)
Là aussi j'aimerais savoir quel est son rôle ? Et avant ça j'ai placé mon micotube une nuit à -20 °C Pourquoi ?

De plus, ma manipulation n'a rien donné, après le passage au spectro (230 à 320 nm) le résultat est plus que négatif (apparement trop de phénol) et un gel d'électrophorèse ne m'a rien donné non plus

Voilà merci à vous

a+ tounch
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[invite02cefc91]

Bonjour,

es ce que tu pourrais déjà développer tout le protocole stp, car la c'est pas très l'ordre des étapes

[invited3919533]

Oui biensûr :
"Tout d’abord nous avons prélevé de jeunes feuilles d’un végétal et nous les avons coupées en morceaux.
Ensuite grâce à un mortier et à de l’azote liquide, nous avons pus broyer les feuilles en une poudre et peser 0,2 g de celle-ci dans un microtube.
600 µl de CTAB 2x et 12 µl de mercaptoéthanol ont été ajouté dans le microtube.
Une fois cela réalisé, nous avons placé notre mircotube dans un bain-marie à 65°C pendant 2 heures.

Après 2 heures, un mélange chloroforme/isoamylalcool (25/1) de 600 µl est ajouté.

Nous mélangeons par inversion de phase et nous plaçons notre microtube dans la centrifugeuse à 2000 rpm pendant 10 minutes.
La phase aqueuse est alors prélevée et 30 µl de RNase (15mg/ml) est ajouté, on incube pendant 30 minutes à 42°C.

Ensuite 5 µl de protéinase K est ajouté et on incube le tout pendant 30 minutes à 42°C.

On inactive le tout pendant 10 minutes à 90°C, ensuite nous ajoutons 600 µl de mélange chloroforme/isoamylalcool et on centrifuge pendant 5 minutes à 3500 rpm.
On prélève la phase aqueuse dans un nouveau microtube dans lequel on ajoute de l’isopropanol au x 2/3 de la phase aqueuse.

On place ensuite le microtube à -20°C pendant toute une nuit.
Nous avons ensuite centrifugé pendant 10 minutes à 3500 rpm et lavé le culot dans 100 µl de tampon Murray-Thompson.

On resuspend le culot et on agite pendant 1 heure et on centrifuge par la suite à 7200 rpm pendant 4 minutes.
Après cela, nous avons jeté le surnageant et lavé le culot dans 500 µl d’éthanol à 70%.

Pour finir cette manipulation nous avons agité le tube pendant 30 minutes puis centrifugé 4 minutes à 7200 rmp. Le surnageant est éliminé et le culot est laissé sécher à l’air libre pendant quelques heures. On resuspend le culot dans 100 µl de TE."

merci

[invitef047ccfa]

salut.

Si tu as fait une electrophorese il est possible que le bain marie t'es servi à bien décompacter tes protéines (ou ADN?), afin de faciliter leur migration.

La nuit : s'est p'tre parce que vous etiez au bout de la journée ? et à -20°C pour que ca ettende le lendemain

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited3919533]

J'avais pensé comme toi pour le congélo mais j'en suis pas si sur,peut être pour figer et stopper les réactions en cours ?
Personne n'a d'idées
merci

[invitef047ccfa]

je crois que je me suis trompé : jette un oeil la dessus (trouvé en cherchant le role du CTAB)
http://popups.ulg.ac.be/Base/document.php?id=1137

[invited3919533]

merci pour le lien, donc la congélation permet de faire précipiter l'ADN apparement. Mais beaucoup de choses m'interepellent encore ...