Bonjours,
je poste ici car g'ai un gros probléme!!
j'effectue des annalyse PCR et pour ça je dois extrére l'ADn seulement depuis une semaine les extractions ne marche plus et j'ai beau changer tous les produits rien ni fait.
Quelqu'un aurrait une idée?
Merci
Salut,
Quelle technique d'extraction utilise-tu? Quels agents? Quelle était ta méthode avant que ça déconne? Quel est ton avis sur la question ? A partir de tout ça, je pense que quelqu'un pourra mieux cibler ton problème et y répondre.
A+.
On uttilise une technique de base que l'on trouve partous sur internet:
CTAB, alcool chloro isoamilique, isopropanol au congéle une nuit, puis alcool et TE 1X.
Le truc c que j'ai un culot au fond a la fin mais c pas de l'ADN (en fin je panse) puisque ça ne donne rien en pcr.
Bonjour,
Tu es sur que tu n'as pas oublié quelques etapes?
ce quoi le CTAB?
Si tu as un culot, ca peut etre des sels, des ARN ou de l'ADN. le mieux est de le déposer sur gel pour voir quel tete ca a. Car une reaction negative en PCR ne signifie pas que tu n'as pas d'ADN
Yoyo
Merci pour le tuyau du gel j'y avait pas penser, par contre ceux qui me fait dire que c'est l'extraction c'est parque avec des ancien test + la pcr marche.
Pour le CTAB c'est mon tampon d'extraction.
Pour des PCRs classiques on est loin d'etre dans la methode classique utilisée par tout le monde!
Pour moi, la methode plus classique pour réaliser des PCRs (mais il faudrait savoir ce que tu veux faire exactement avec ces PCRs; ca change la donne.) c'est:
extraction phénol-chloroforme (on peut fignoler en faisant phénol/phénol-chlo/chlo)
Ethanol 100%
Ethanol 70%
sechage et reprise dans de l'eau.
Pour des PCRs de routine, ca n'a pas besoin d'etre plus compliqué que cela.
Sinon j'attire ton attention sur le fait que si l'ADN est trop concentré au final, on inhibe totalement la PCR! C'est un peu paradoxal mais c'est comme ça. Donc pour les PCRs, il faut bien diluer des ADNs (même problème avec les cDNAs en qPCRs d'ailleurs, c'est rédibitoire.)
Cordialement,
piwi
Ca semble contradictoire, mais en fait c'est par titration des ions Mg2+ que ca inhibe la PCR. Si l'ADN est trop concentré alors il suffit d'augmenter la quantité de Mg2+ dans le tampon.Sinon j'attire ton attention sur le fait que si l'ADN est trop concentré au final, on inhibe totalement la PCR! C'est un peu paradoxal mais c'est comme ça.
YOyo
Un petit truc que j'ai l'impression d'avoir oublié, le Mg2+ il stabilise la structure en double hélice en se liant aux oxygénes chargés négativement des groupements phosphate de l'ADN, c'est ça? Mais en plus de ça il active les DNases aussi car souvent on met de l'EDTA pour capter ces ions afin de ne pas avoir perte de matos lorsqu'il ya lyse cellulaire, c'est ça?
Merci d'avance, A+.
slt tout le monde,
d'abord à partir de quoi extrais tu ton ADN? Est ce que tu l'extrait du mmtype de cellule? Sinon apres l'extraction et avant de faire la PCR il vau mieu verifier sur gel ou par spectrophotometrie la concentration et l'integrité de ton ADN. Sinon j'ai testé different protocle d'extraction et le rendemen est en générél kifkif. Tu peut tjs utiliser un kit si tu a ca sous la main ce qui te permet d'avoir un peu d'ADN rapidemen pour ne pas perdre trop de tps...
Sinon tu as peut etre un probleme de PCR. utilise tu un temoin Positif?
J'ais fais quelque vérification par spectro et il se trouve que j'ai bien de l'adn dans mes extractions, le probléme dois donc vennir d'ailleur.Soit j'ai un inhibiteur quelque pars soit ma pcr a des soucis le truc c'est que mes temoins sont positifs.
Salut,
tu as essayé de quantifier l'and contenu DANS ton produit pcr? ca te renseignera ou se situe ton probleme (agarose, tampon de depot ou tampon de migration contaminés avec des dnases).
A+
Dans ce cas diminue la quantité d'ADN que tu mets dans ta PCR (fais des gammes) et augmente le nombre de cycles.Envoyé par lililala
J'ais fais quelque vérification par spectro et il se trouve que j'ai bien de l'adn dans mes extractions, le probléme dois donc vennir d'ailleur.Soit j'ai un inhibiteur quelque pars soit ma pcr a des soucis le truc c'est que mes temoins sont positifs.
