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Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte



  1. #1
    Zouhir1

    Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    Bonjour,
    S'il vous plait, je veux détecter des médicaments en utilisant la technique d'ELISA par compétition indirecte (anticorps de capture est polyclonal), j'ai fais plusieurs optimisation mais mais je n'arrive pas à obtenir une bonne DO, soit je trouve une DO= 0.1... ou DO= 4 ou plus, pourriez vous m'expliquer en détail comment faire car j'ai cherché sur internet, mais je n'arrive pas à trouver les étapes en détail pour faire l'optimiser.
    Merci beaucoup

    -----


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  3. #2
    Flyingbike

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    vous avez optimisé quoi ?

    la concentration de l'ac de capture ? la concentration de l'ac de détection ? vous voulez détecter quoi dans quoi ?
    La vie trouve toujours un chemin

  4. #3
    Zouhir1

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    Bonjour,
    Merci beaucoup pour votre réponse, j'ai essayé de varier les concentrations de l'anticorps de capture, et la molécules compétitive (Benzodiazepine-HRP) couplée à la hrp en même temps.
    S'il vous plait Monsieur, je suis bloqué, avez vous un document ou autre chose qui explique en détails les étapes à suivre pour optimiser l'ELISA compétitive indirecte car sur internet je ne trouve que l'ELISA sandwich et qui n'a pas le même principe que la compétitive ?
    Merci merci

  5. #4
    Flyingbike

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    Non désolé
    Je n’ai jamais fait d’elisa par compétition

    Vous avez bien une do faible sans benzo-hrp?
    Et combien avec que de la benzo-hrp?
    Vous avez fait un étalon avec différents rapports de benzo/benzo-hrp ?

    Je pense qu’il faut commencer par trouver la concentration minimale de benzo-hrp qui donne une do max, pour pouvoir fêter ter facilement les benzo non couplées
    Donc vous avez fait une gamme de benzo-hrp seule ? Ça donne quoi ?
    La vie trouve toujours un chemin

  6. #5
    Zouhir1

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    Vous avez bien une do faible sans benzo-hrp?
    Je n'ai pas testé ça encore, mais c'est normale je pense, car la substance qu'on veut doser n'est pas marquée

    Vous avez fait un étalon avec différents rapports de benzo/benzo-hrp ?
    Non et pourquoi ?

    Je pense qu’il faut commencer par trouver la concentration minimale de benzo-hrp qui donne une do max, pour pouvoir fêter ter facilement les benzo non couplées
    Oui c'est ce que je voulais faire

    Donc vous avez fait une gamme de benzo-hrp seule ? Ça donne quoi ?
    Et combien avec que de la benzo-hrp?

    Oui exactement, dans un premier temps nous avons utilisé les concentrations 20, 30, 40, 50, 60, et 80 ng/ml de bnzo-hrp. et nous avons coater 1, 2, 3, 4, 5, 6 d'anticorps anti benzo mais nous avons obtenus presque les mêmes DO = 0.1 et 0,2.

    puis nous avons tester les concentration de 600, 700 et 750 ng/ml, ils donnent DO= 3 et les concentration de 800 ng/ml et 1µg/ml de bnzo-hrp donnent successivement DO= 1.2 et DO= 2.1, donc comment expliquer ça ? est ce que notre HRP est dégradé ou quoi ?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Flyingbike

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    Il faut faire varier un seul facteur à la fois
    Disons que la concentration d’ac est la même partout
    Moi j’aurais fait une gamme plus large
    Genre 1-10-100-1000ng/ul
    A un moment la do doit atteindre un plateau
    Il faudrait choisir la concentration juste en dessous de ce plateau
    Et ensuite tester cette concentration en ajoutant plus ou moins de benzo non marquée
    Et corréler la do avec la concentration de benzo non marquée
    La vie trouve toujours un chemin

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  10. #7
    Zouhir1

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    Oui pour les concentration de 600, 700 et 750 ng/ml, qui donnaient une DO= 3 et les concentration de 800 ng/ml et 1µg/ml de bnzo-hrp qui donnaient successivement les DO= 1.2 et DO= 2.1 nous avons fixé la concentration de l'anticorps de capture à 6 µg/ml.
    Comment corréler la do avec la concentration de benzo non marquée, car on auras pas de coloration (l'intensité de coloration est inversement proportionnelle à la concentration de la substance à quantifier).

  11. #8
    Flyingbike

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    il faut fixer la concentration en anticorps et en benzo HRP

    ensuite, rajouter plus ou moins de benzo non marquée devrait déplacer la benzo HRP et vous donner une corrélation inverse en effet


    Disons que vous êtes a 600ng/mL de marquée, si vous faites une gamme de non marquée (a incuber en même temps) de par exemple 0, 1, 10, 100, 1000, 10000 voire 100 000ng/mL, vous devriez obtenir une courbe de ce style :

    ab215527-270565-215527a.jpg
    La vie trouve toujours un chemin

  12. #9
    Zouhir1

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    Esct ce que je dois ajouter la benzo non marquée et la bnzo-hrp en même temps ou j'ajoute la bnzo-hrp puis la benzo et avec quel volume ?

  13. #10
    Flyingbike

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    je pense qu'il faut faire un mix marquée/non marquée avant et déposer après


    le volume doit être constant partout donc il faut compléter avec le diluant
    pour le volume j'en sais rien, 100µL sauf si ce sont des plaques half area
    La vie trouve toujours un chemin

  14. #11
    Zouhir1

    Re : Mise au point d'ELISA Compétitive indirecte

    Merci beaucoup Monsieur Flyingbike, je vais essayer de faire ces étapes et je vous tiens au courant

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