Normalisation RT-PCR quantitative

[inviteb1bb73ed]

Bonjour à tous!

J'utilise depuis peu de temps la technique de RT PCR quantitative en temps réel. Je suis à la recherche d'un protocole ou d'un quelconque papier qui pourrait m'expliquer la normalisation des résultats.

En fait, on m'a dit de réaliser des gammes de plasmides, puis on 'a dit de réaliser des dilutions de RT pour faire ces gammes...

En gros, je suis perdue!!! Je ne comprends pas les Delta de Delta de Ct et je viens de découvrir qu'il faut tenir compte de l'efficacité...

Bon j'arrête de raconter des trucs pas forcément clairs pour vous mais autant vous dire que je touche le fond!

Si un âme charitable aurait quelque chose pour me sauver, je la remercie de tout coeur!!
-----

[invitec4829296]

Bonjour,

c'est vrai que la présentation et l'exploitation des résultats de PCRq en temps réel ne sont évidentes.
Commençons par le début.

La PCRq (je ne mets plus temps réel, c'est trop long) indique le cycle au cours duquel la fluorescence dépasse un certain seuil (fixé arbitrairement par l'utilisateur... dans la phase exponentielle). Ce cycle est noté Ct (threshold cycle = cycle seuil). La valeur du Ct est proportionnelle au nombre de copies de l'ADN amplifié (=cible) présentes au départ dans l'échantillon (d'ailleurs c'est ce qu'on essaye de mesurer avec la PCRq). Plus la quantité initiale d'ADN cible est grande, moins il faut de cycles de PCR pour atteindre le seuil de fluorescence.

QUANTIFICATION RELATIVE
Pendant la phase exponentielle de la PCR, la quantité d'ADN double à chaque cycle, ce qui signifie qu'une différence d'un cycle entre 2 Ct correspond à une différence d'un facteur 2 des quantités initiales d'ADN cible. C'est le 1er "delta de Ct".
En gros, il te permet de dire "j'ai [2 x delta Ct] fois plus d'ADN cible dans cet échantillon par rapport à cet autre échantillon", c'est-à-dire le plus souvent, "mon gène est n fois plus exprimé dans cette condition spécifique par rapport à ma condition témoin".

Le problème, c'est que tes 2 échantillons ne sont pas probablement tout à fait à la même concentration. Pour corriger ce facteur, on réalise souvent une 2e PCR avec un gène de contrôle dont l'expression est censée ne pas varier entre les 2 conditions. Dans ce cas, tu vas comparer l'écart de cycle entre le Ct de ton gène-cible et le Ct de ton gène de contrôle dans chacun des 2 échantillons. Ca te donne 2 "delta de Ct", si tu les compares entre eux tu obtiens le fameux "delta delta de Ct".

Personnellement, je n'aime pas trop la méthode du "delta delta de Ct", car je trouve que ça induit un biais supplémentaire. En effet, rien ne te dit que l'expression de ton fameux gène de contrôle n'est pas un peu modifiée quand même par le traitement. Je préfère doser soigneusement mes ARN au spectro et faire toujours ma RT avec la même quantité d'ARN (5µg) et rapporter l'expression du gène à la quantité d'équivalent ARN totaux.

QUANTIFICATION ABSOLUE
Mais le problème de la méthode des "delta delta de Ct", est que c'est de la quantification relative, i.e. mon gène est n fois plus/moins exprimé que tel autre. Si tu veux faire de la quantification absolue, il te faut faire une gamme-étalon avec des quantités connues d'ADN et comparer le Ct de ton gène cible avec les Ct de la gamme.
Souvent, les gammes sont faites avec des plasmides portant la cible. Comme tu connais exactement la séquence de ton plasmide, ou au moins son nombre de bases, tu peux calculer sa masse moléculaire, et de là, en déduire le nombre de copies de plasmide par mg d'ADN. Si tu fais une gamme avec 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, tu peux la convertir en nombre de copies.

Personnellement, je trouve que cette méthode a des limites : les plasmides sont si petits qu'il faut utiliser les concentrations très faibles d'ADN (fg). Dans ce cas, l'ADN a tendance au bout d'un moment à se coller aux parois des tubes en plastique (charges électrostatiques) dans lesquels tu stockes ta gamme. La concentration de plasmide en suspension rique de diminuer au cours du temps. De plus, si tu compares plusieurs gènes, tu utilises différentes prep' de plasmides, une pour chaque gène et tu n'es jamais sûre d'être exactement à la même concentration dans toutes tes prep'. En plus ça t'oblige à avoir cloné chaque gène que tu souhaites étudier...

La solution "universelle" est de faire une gamme d'ADN génomique : le génome haploïde comporte un exemplaire de chaque gène, i.e. 1 copie. Si tu connais la masse d'un génome haploïde (j'ai trouvé une publi avec la masse d'un centaine de génome végétaux par cytométrie en flux), tu peux calculer le nombre de génomes haploïdes contenus dans une quantité donnée d'ADN génomique, c'est à dire le nombre d'exemplaire de chaque gène. 1 équivalent-génome = 1 copie du gène.
En construisant ta gamme-étalon avec de l'ADN génomique, tu as la même référence pour étudier tous tes gènes. Tu peux même concevoir un couple d'amorces qui amplifie une partie d'ADN non codant pour vérifier que tes prep' d'ARN ne contiennent pas trop d'ADN génomique. (La préparation des ARN pour la PCRq, nécessite une étape à la DNase, justement pour éviter cette contamination).

GAMMES DE RT
Réaliser la PCRq avec 3 dilutions de la même RT permet de vérifier que le nombre de copies du gène cible est bien proportionnel à la quantité de RT. Si ce n'est pas le cas, on a saturé la réaction (trop d'ADN -> diluer) ou on est dans le bruit de fond (pas assez d'ADN, mettre + de RT).

Voilà, j'espère que ça répond à tes interrogations. Désolée d'avoir été si longue.

Annaïck.

[inviteba44b9ab]

Bonjour,

voici un lien qui est tres tres utile, je te recommende de l'ajouter a tes favoris si tu te lances dans la RT-PCR
http://www.protocol-online.org/prot/...PCR/index.html

commence par le papier de T. Dorak, c'est une excellente base.
Good luck

[gorben]

Salut,

Pour compléter je dirai juste que tu peux également faire ta gamme à partir de produits PCR. Ca se manipule mieux que l'ADNg et pas de clonage nécéssaire.
Pour palier à la fixation de l'ADN sur les parois du tube, il existe des tubes "low binding" qui ont été développé spécifiquement pour la RTqRTPCR

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteb1bb73ed]

Merci beaucoup pour vos réponses!

Il semblerait (décision du chef oblige... ) que je me dirige vers une dilution de RT...

(et c'est maintenant que je me demande "mais pourquoi ai-je choisi ce sujet de thèse??" )

En tout cas, re-merci pour vos messages!

[invitec4829296]

Bonjour,

ce n'est pas grave de faire la gamme avec une dilution de RT, c'est juste que tu feras de la quantification relative et pas absolue.

Mais discute bien avec ton chef (je sais, c'est pas toujours évident) pour connaitre les raisons de son choix. "Il a toujours fait comme ça", "c'est un de ces collègues qui lui a dit/il a vu des papiers où les gens faisaient comme ça" OU "il y a un argument imparable spécifique à ton sujet de thèse qui fait que c'est LA façon de faire la plus adaptée" ?
Dans les 2 premiers cas, si tu trouves une meilleure solution que la dilution de RT, essaye d'argumenter. Après tout, c'est toi qui fait les manip' : si tu veux faire plus compliqué que ce qu'il te propose (mettons que c'est un de ces arguments), c'est ton problème ... sauf si tu dépenses beaucoup plus de sous !

Je ne comprends pas bien l'intérêt de faire des dilutions de RT, car chaque gène a une expression différente. Il doit y avoir un truc. Tu aurais une explication ?

C'est quoi ton sujet de thèse ?

Annaïck.

[inviteb1bb73ed]

En fait, mon chef n'est pas non plus un spécialiste de la technique. Il se base sur la façon de faire de personnes qui travaillent sur le même matériel que moi (pas forcément les mêmes conditions). Et crois-moi, j'en discute le plus possible!

L'autre raison du choix des RT, c'est les remarques qui ont été faites lors de mon comité de thèse (2 membres sur 4 utilisent la technique des RT diluées donc forcément, c'est "le meilleur choix"! ).

Voila voila... Avant de me lancer, je vais quand même essayer de me documenter le plus possible!

En ce qui concerne mon sujet de thèse, il traite de l'Influence de la lumière sur la ramification du rosier. En gros, la PCR quanti va me permettre de suivre l'expression de gènes candidats lors du débourrement du bourgeon axillaire de rosier, sous différentes conditions de lumière.

En gros la quantification absolue n'est pas vraiment nécessaire. Ce que je veux, c'est plus une cinétique, ou une comparaison entre deux conditions environnementales... Style "lumière entraine augmentation de l'expression, obscurité entraine diminution de l'expression...".

Re-merci pour toutes ses réponses!

[inviteba44b9ab]

Bonjour,
mon avis c'est que ca coutera moins de faire une dilution des RT... mais bon, ca reste a confirmer en fonction de ce que tu as a disposition dans ton labo
courage en tout cas, c'est pas si difficile que ca. J'ai commence la RT-PCR en mars, il n'y a pas de specialiste dans mon labo pour m'eclairer plus que ca et je m'en sors assez bien. Et je n'ai pas 15 ans d'experience derriere moi, j'ai ete diplome (ingenieur biotech/DEA bio mol et cellulaire) en septembre dernier, donc c'est comme si j'etais au debut d'une these. Fais bien le tour des publis (notamment sur le lelin que je t 'a indique) et ca ira

[invitec4829296]

En ce qui concerne mon sujet de thèse, il traite de l'Influence de la lumière sur la ramification du rosier. En gros, la PCR quanti va me permettre de suivre l'expression de gènes candidats lors du débourrement du bourgeon axillaire de rosier, sous différentes conditions de lumière.

Il a l'air chouette ton sujet de thèse, tu as combien de gènes candidats à tester (et combien de conditions) ?

Si j'ai bien compris, tu veux comparer l'expression de chaque gène dans les différentes conditions d'éclairement et de développement du bourgeon axillaire sans t'intéresser à leur niveau d'expression global.
Si c'est bien ça, tu n'as, en effet, pas besoin de faire de gamme d'ADN génomique ou de produit PCR ou de plasmide. C'est un peu comme en Northern quand tu exposes plus ou moins longtemps le film sensible.

Par contre, il faudra peut être que tu rapportes tes Ct à la quantité de RT (ou d'ARN total initial) dans certains cas. Car parfois, il faut diluer beaucoup pour avoir un Ct "correct", c'est-à-dire non saturé et hors du bruit de fond. En gros, je gardais les Ct entre 20 et 35 (mais j'avais ma gamme d'ADNg pour me guider).

Petite info : comme l'unité de mesure de la PCRq est logarithmique, toute différence d'expression inférieure à un facteur 2 (i.e. une différence d' 1 Ct) est non significative.

Annaïck.

[invitec4829296]

Pour info, les références de l'article dans lequel ils ont mesuré le poids du génome de plus d'une centaine de plantes par cytométrie en flux.

Arumuganathan K & Earle ED (1991) Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Mol Biol Rep. 9: 208-218.

Annaïck.

[inviteb1bb73ed]

Merci pour la référence de la publi.

Pour répondre à tes questions, j'ai pour l'instant, une dizaine de gènes candidats que je regarde dans 6 conditions différentes (lumière du jour T0, T1, T6 et obscurité TO, T1, T6). Selon les résultats que j'aurais en lumière du jour, je ne garderais que deux ou trois gènes réellement intéressants pour faire l'étude sous des longueurs d'ondes différentes (bleu, rouge etc...).

Je vais tenir compte de ta remarque pour la valeur de Ct comprise entre 25 et 30! C'est ce que j'avais déjà pour mes premiers résultats... (Ouaiiiis! Quelque chose de bien! ).