RT PCR quantitative

[invite481f0dd7]

Bonjour
je souhaiterai effectuer une pcr quantitative a partir de mes ARN mais je ne connais pas trop la technique;...
donc si quelqu' un avait de la doc ou des protocoles ca me rendrait enormement service.
merci
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[piwi]

Salut.

Je pense qu'il faut que tu procèdes en deux temps. Une RT puis des Q-PCR sur ton produit de RT.
Pour la RT tu peux procéder à l'ancienne ou avec un kit (le quantitec de quiagen est tres bien)

a l'ancienne:
1.
5 microL d'arn (1 microG/microL) + 7.5 microL d'oligo dT (0.2 microG/microL) qui serviront d'amorces pour répliquer tes ARNm.
10 mins à 70°C puis 5 mins sur glace

2. mix RT
Tp RT 5x 8 microL
dNTPs 10 mM 4 microL
Rnasine 40U/microL 1 microL
13.3 microL H₂O

3.
ajouter le mix aux ARN et incuber 10 mins à TA.

4. Ajouter 1.2 microL AMV reverse transcriptase et hop 1h à 42°C

5.
enfin 5 mins à 95°C et puis apres sur la glace 5 mins.

6.
dilution dans 200 microL

Avec le kit c'est plus facile, plus rapide et plus propre...


Pour les Q-PCR j'utilise aussi le kit sybrgreen de quiagen. On peut travailler avec 1 microL d'ARN + 9 microL de mix d'amplification (vol final 10 microL). C'est archi facile!


Voilou.

[invite00aa1503]

Bonjour,
Effectivement comme l'a dit Piwi, pour réaliser une RT-PCR quantitative à partir d'ARN, il faut d'abord que tu réalises une reverse transcription de tes ARNs.
Dons mon laboratoire nous utilisons le RNA Archive kit d'Applied biosystems. Ensuite la PCR quantitative en temps réels est réalisé sur le robot 7900Ht tjs d'Applied biosystems selon la technologie Taqman.
En plus des amorces reconnaissant l'ADNc voulu il y a dans le kit PCR une sonde possédant à ses extrêmités une molécules fluorescente et un quencher qui inhibe la fluorescence. Lorsque la Taq polymerase agit, elle va "détruire" le quencher et la sonde va pouvoir émettre une lumière. Donc plus tu auras d'amplification et plus ton signal fluorescent sera grand. C'est une mesure de cette fluorescence qui sera établit.

Je ne sais pas si tout ça est assez clair mais en tout c'est une technique possible pour réaliser de la Q-RT-PCr à partir d'ARN.

[invitec4829296]

Salut,

quand tu parles de RT-PCR quantitative, tu souhaites faire
(1) une RT-PCR semi-quantitative
ou
(2) une RT-PCR quantitative en temps réel?

Dans le 1er cas, un appareil à PCR normal suffit.
Dans le 2e cas, il faut un appareil spécial (très cher). Il y en a en général un pour tout un institut. Le plus simple est d'aller voir les personnes qui l'utilisent déjà pour avoir les réponses à tes questions.

Dans les 2 cas, je te conseille de préparer soigneusement des ARN "ADN-free" = après extraction de tes ARN, tu les traites à la DNase. J'utilisais le kit RNeasy de Qiagen (colones) en faisant le traitement à la DNAse (Qiagen) directement sur la colonne pendant l'étape de lavage des ARN. Comme ça la DNase est eliminée au lavage. Après l'élution tu as des ARN tous propres, sans DNase (problématique pour l'étape de PCR suivante !) et sans ADN génomique qui te donnerait des résultats faussement positifs et sur-estimés.

Annaïck.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec4829296]

PS: je te propose de jeter un coup d'oeil sur ma thèse, téléchargeable ici (site thèses-en-lignes ):

http://tel.ccsd.cnrs.fr/docs/00/04/7...l-00007807.pdf

en particulier les pages 128-133 du Matériel et méthodes et le 1er chapitre des résultats (p.37-66)

Annaïck.

[invite481f0dd7]

merci!!!!
(j avais pas ce fil et j avais oublié que je l avais lancé ; alors je viens de voir vos réponses....

[invite76a11b12]

bonjour!
Je suis étudiante a Grenoble, et dans le cadre d'une UE, je dois utiliser la RT PCR afin d'obtenir une quantification de mes ARNmessagers, mais je ne connais pas grand chose sur cette méthode, quelqu'un peut il m'aider?
Merci