Comment analyser les résultats de PCR quantitative???

[invited953aa87]

salut,

J'ai un grand problème pour l'analyse des résultats de la qPCR, en faite j'ai 4 gènes cibles avec la bactin comme référence endogène.

J'ai fais l'extraction et la RT et ça très bien marché, ça me reste la quantification par le syber green. Je cherche quelqu'un qui peut m'expliquer d'une façon simple le principe d'analyse ou qui peut m'orienter vers un site ou un doc qui peut m'aider (mon encadreur m'a dit débrouille toi!!!!!).
Est ce qu'il existe un logiciels qui fait ces analyses???

merci pour votre aide, j'attends vos réponse
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[invite4ff9937a]

Salut

Je n'est peut être pas trés bien compris ta question alors excuse moi si ma réponse n'est pas celle que tu attends.

Tout d'abord tu dois faire une droite étalon avec ton gène référence " bactin".
Cette droite est "cycle critique en fonction de la concentration en ADN initiale" exprimée en log de copie d'ADN.
Plus ta concentraion en ADN initiale est élevée plus ton cycle critique apparait tôt.

Ensuite grâce aux cycles critiques des 4 génes que tu étudies tu peux retrouver grâce à la courbe la concentration initiale en ADN pour tes 4 gènes.

Normalement ceci s'effectue sur l'ordinateur relié directement à la qPCR.

voilà j'éspére t'avoir été utile

marc

[invited953aa87]

merci pour votre réponse mais je dois choisir entre la quantification relative avec un gène endogène et la delta ct delta ct ou une courbe standard??
JE VOIS PAS CLAIRE l'exigence de chacune de ces deux méthodes de quantification,

amicalement

[LXR]

Salut,

Moi j'utilise la quantification relative, mais je regarde l'expression de gènes sous plusieurs conditions pharmacologiques. J'ai donc un témoin, qu'on appelle le basal, qui nous donne une quantité arbitraire d'ARNm en Ct, il représente l'expression basale. Puis on compare les valeurs de Ct des autres conditions pharmacologiques, par rapport à ce basal. On se retrouve donc avec, par exemple, une expression de 2,3 pour un gène X dans une condition Y. Cela veut dire que X est exprimé 2,3 fois plus dans la condition Y que dans la condition de base.
Dans le cas de l'évaluation de l'expression de gènes dans différentes conditions, le relatif reste le mieux pour moi. L'absolu interviendrait surtout pour universaliser les données produites.

Une question : qu'est ce que tu utilises comme appareil qPCR, et quel est le programme d'exploitation des données?

Cordialement,

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invited953aa87]

Bonjour,
Merci bien de m'avoir répondu, si j'ai bien compris nous avons le même principe de recherche. En effet, j'ai 3 groupes de rats : témoin (noté T) que vous notez basal; traité 1 (noté M) et traité 2 (noté MAC).
Mon objectif est d'évaluer l'expression de 4 gènes au niveau de l'hypothalamus à savoir nNOS iNOS BDNF et CRF dans les deux conditions M et MAC par comparaison à la condition contrôle (T).

Je travaille sur un ABI PRISM 9500 (ancien) mais en septembre J'ai la possibilité de travailler sur l'ABI PRISM 7000, je connais pas les conditions d'exploitations (j'ai passer une seule fois près de l'automat sans le toucher!!!!).
Bref,
Donc je doit m'orienter plutôt à la quantification relative mais j'ai une question: je dois faire la quantification avec delta delta ct ou une comparaison simple des ct après avoir mis la même quantité D'ARN?? suivi d'une analyse ANOVA pour les 3 groupes avec n=5 éch pour chacun?

Pour conclure je dois faire:
-très bonne lecture au spectro pour mettre la la même quantité D'ARN
-lecture des ct
-analyse ANOVA
C'est ce que j'ai compris!!?

SVP si vous avez un e ref un peu detaillée n'hésitez à me l'envoyez ,si vous le permettez bien sûr.
Merci
amicalement,

[invited953aa87]

Salut,
je suis une doctorante en biologie et j'ai un problème avec l' analyse des resultats Q-RT PCR.
J'ai 3 groupes à condition différente: un témoin T; traité1 M et traité 2 MAC avec n=5/groupe.
1/je me demande si c'est suffisant d'utiliser un seule gène endogène ou je dois ajouter d'autres??
2/Si je vais faire une quantification relative avec la 2-delta delta Ct ensuite comment je vais faire l'analyse ANOVA et quand c'est significatif??
3/le calcul de la 2-delta delta Ct se fait par excel (manuellement) ou par un logiciel?? J'ai pas bien compris ça dois dépasser 2 pour ke ça soit significatif?
4/ comment faire une gamme standard avec RT: RT du groupe témoin seul ensuite on projète les CT de chaque éch???
Je m'excuse si je vous ai dérangé par ces questions mais mon encadreur n'est pas spécialiste de la technique, pour cela j'ai plusieurs questions qui tourne dans ma tête:conf
merci d'avance,
amicalement,

[emma59]

Bonjour!

En ce qui concerne l'analyse des CT s'il existe un logiciel il doit figurer sur le PC connecté à l'automate qPCR. Tu devrais demander à ceux qui utilisent la machine de ton service.
Dans mon ancien labo, on utilisait le mx 4000. Moi, j'utilisais le logiciel qui me donnait directement mes résultats mais d'autres préféraient refaire les calculs sous excel evec les deltas de CT et retrouvaient le même résultats. C'est juste une question de préférence.
En ce qui concerne les courbes standards de RT, moi je ne le fais que pour vérifier l'efficacité de la PCR pour un type de primers donné; c'est mieux d'utiliser les témoins.
bon courage
amicalement

[Annaick_R]

Bonjour,

j'aurais tendance à réagir comme emma59 : pour commencer, discute avec les personnes qui utilisent la machine. C'est plus simple et elles sauront mieux que nous les "trucs" spécifiques à son utilisation.
Je ne vais pas pouvoir répondre à toutes les questions (notamment celle sur l'ANOVA). Mais je vais essayer de t'aider.

3/le calcul de la 2-delta delta Ct se fait par excel (manuellement) ou par un logiciel?? J'ai pas bien compris ça dois dépasser 2 pour ke ça soit significatif?

La PCR quantitative se base sur le fait qu'à chaque cycle on double la quantité de la séquence cible. Et que pendant la phase exponentielle (quand aucun élément de la PCR n'est limitant) la quantité d'ADN cible à un cycle donnée est proportionnel à la quantité initiale de la cible.
si on a au départ 10 copies d'un ADNc précis, on aura n x 10 copies au 20e cycle de la PCR.
si on a au départ 20 copies, on aura n x 20 copies au 20e cycle.
Au 20e cycle, la fluorescence dans le 2e cas (20 copies) sera 2 fois plus forte que dans le 1er cas (10 copies).

En fait, plus le nombre de copies de la cible est faible au départ, plus il faut de cycles de PCR pour atteindre un niveau de fluorescence donné. Inversement, plus le nombre de copie est important au départ, plus le nombre de cycles pour atteindre le même niveau de fluorescence.

C'est ce nombre de cycles qu'il faut réaliser pour obtenir une certaine quantité d'ADN cible et de fluorescence qui est utilisé en PCR Q. Il est appelé cycle-seuil ou Ct (t pour threshold, ou seuil en anglais).

Comme on double la quantité d'ADN à chaque cycle, une différence d'un Ct entre 2 échantillons correspond à une différence d'un facteur 2 en quantité d'ADN cible.
si Ct₁ = 20 et Ct₂ = 19, il a 2 fois plus de copies de la séquence-cible dans le 2e échantillon.

J'arrive à la précision du facteur 2. La PCR marche par cycle de doublement de la quantité d'ADN-cible. Au cycle c, on a n copies de la cible, au cycle c+1, on a 2n copies dans le tube. La précision de la mesure par l'appareil est de +/- 1 cycle, donc plus ou moins un facteur 2. C'est impossible d'avoir une différence fiable de moins d'un cycle donc de moins d'un facteur 2.

Voilà pour aujourd'hui.

Annaïck.

[Effie]

jajooo et Annaick_R, j'ai utilisé la PCR en temps réel par light cycler (avec normalisation en delta de delta ct) durant ma thèse; envoyez-moi votre adresse mail par MP si cette partie de mes matériels et méthodes vous intéresse, c'est tout détaillé (et corrigé par un chercheur confirmé dans le domaine, pas comme moi qui suis physiologiste!)

Les autres qui sont intéressés peuvent bien évidemment me contacter aussi, par contre désolée pour les lecteurs du forum mais je n'ai plus les détails en tête (j'ai soutenu il y a un an) donc je ne développerai pas ici....

[invited953aa87]

Salut,
Merci infiniment pour vous tous, vous étiez très utiles pour moi et vos réponses m'ont beaucoup intéressé.

[invitee8b3f97e]

Salut !

Je ressors ce sujet sur la RT QPCR, et plus particulièrement sur le calcul des quantité relative d'expression par la méthode des 2^DDCt.

J'ai donc mes échantillons en triplica, ma condition stantdart, mon gène de référence et tout le toutim.

Je fais mes calculs par la méthode indiquée (Livak and schmittgen 2001, Methods 25). Et là je bute sur un truc tout con : la valeur que je trouve à la fin (la fameuse 2^DDCt), qu'indique t'elle réellement ?

La valeur de 2^DDCt de mon échantillon témoin est de 1 : OK, c'est normal.

La valeur de 2^DDCt de mon échantillon A est aussi de 1 : pas de variation d'expression non plus dans cette condition.

La valeur de 2^DDCt de mon échantillon B est de 0,5. Certe

Est ce que cela veut dire que mon gène de cible est exprimé 2 fois moins dans cette condition que dans la condition standart ? Pourtant la valeur de DCt diminue : le Ct moyen de mon gene de ref reste aux alentours de 28, mais la valeur de Ct moyen de mon gene cible passe de 16 à 18,5.

Ces deux infos me semblent en complète contradiction, please help !!

[invite845c7802]

Bonjour,
Je voudrais avoir quelques rensiegnements. Je réalise des PCR en temps réel et j’ai choisi la methode des delta Ct . Après avoir mis au point la technique (vérification efficacité de PCR des différents gènes…..) je dois désormais analyser mes résultats.
Le but de mon projet est de comparer l’expresion de certains génes dans des tumeurs et le tissu sain chez différents patients.
Je ne peut pas choisir de lignée cellulaire tumorale comme standart puisque nous n’avons pas le matériel pour faire de la biologie cellulaire au sein de mon laboratoire.
Initialement je souhaitaits prendre le tissu sain d’un des patitents comme standart, le problème est le suivant : après avoir réalisé la PCR, j’ai remarqué que le Ct des différents gènes étudiés varie énormément d’un patients à un autre.
De ce fait je pensais réaliser l’analyse de la manière suivante :
Pour chaque patients, je vais étudier l’expression des gènes dans la tumeur en prenant comme standart le tissu sain correspondant au patient en question.
Ainsi je n’aurais pas un seul standart mais un standart pour chaque échantillon..
Pensez vous que cette démarche est correcte.

[IngDr]

L'intérêt du standard est de pouvoir calculer l'efficacité de la PCR.[ Rappel Q(i+1) = Q(i) x E, avec Q(i) la quantité d'ADN au cycle i, et E l'efficacité d'amplification. On considère souvent, à tort, que E=2, or si l'on compare 2 gènes ayant des efficacité d'amplifications différentes et que l'on prend E=2 pour chaque gène, on induit une erreure, d'autant plus grande que le delta Ct est grand et que la différence entre les efficacités est grande. ] Faire une gamme par echantillon permettra de calculer l'efficacité de la PCR dans chaque echantillon sain, mais ne permettra pas de faire la quantification absolue car la quantité de cDNA correspondant au gène cible dans le tissu sain n'est pas connu.
Dans ce cas il faut faire une quantification relative par rapport à un gène de référence (l'idéal est d'en utiliser plusieurs, car dans les cancers, certains housekeeping gene peuvent varier différement d'une tumeur à l'autre).

Dans un cas similaire, pour avoir un standard qui ne soit pas "faussée" par le fait de n'étudier que des ADNc provenant d'un seul patient (car le gène n'était pas exprimé fortement chez certains), nous avions, pour le standard uniquement, mélangé les ADNc provenant de différents patients.
Mais dans ce cas, il faut s'assurer d'avoir un standard suffisement étendu pour que toutes les valeurs de Ct des tissus tests soient comprises dans la gamme.

Je ne pense donc pas qu'il soit nécessaire de faire une gamme par patient. Car en plus cela prendra beaucoup de points pour la PCR, et réduira d'autant plus le nombre de patients ou de gènes testés dans le même run de PCR.

[invite636bb1a8]

Bonjour,
Je profite de cette discussion déjà crée car son titre correspond en effet à ce dont j'ai besoin.
En effet, j'ai réalisée des manips de RT puis qPCR et j'ai eu mes résultats envoyés du labo où cela a été réalisé ce matin (je travaille dans un autre labo).
Lorsque mon chef le as vu, il m'a sermonné car pour lui cela ne veut rien dire du tout, pour demain matin je dois tout expliquer (les graphiques "quantitation" et "melting curve" ainsi que comment j'obtiens ensuite le graphique de fold change).
Le problème est que je n'ai aucune de ces connaissances et que je ne sais vraiment pas comment on fait pour expliquer tout cela.
Je pense avoir à peu près compris le graphique "Quantitation" mais pour le reste, je suis complètement incapable de l'expliquer.
Cordialement,

[invite6a76d75a]

salut! bonne année à tous!
est ce qq'un pourrait m'aider à comprendre la quantification relative des ARN par PCR temps réel avec courbe standard et delta Ct.??? J'ai rien compris à ce qui est écrit sur internet. c urgent! c la partie calculs que je comprend pas c kelle courbe et c kelle formule ? Je suis perdue je dois faire une présentation claire qui explique tout ça

Myriam36

[Moumoutte]

Bonjour,

effectivement, il semblerait que tu fasses quelques confusions sur le sujet.
Si tu parles de quantification relative, tu n'as normalement pas besoin de courbe standard (nécessaire à la quantification absolue par contre).
Tu compares juste tes échantillons entre eux avec pour conclusion quelque chose du genre "la concentration en ADN de tel échantillon est 10 fois plus élevée que dans celui-ci"
Pour cela il est vrai que tu utilises des formules barbares avec des delta Ct (DCt)

Pour faire de la quantification relative, il est nécessaire de définir un gène cible qui servira de contrôle endogène.
En quantité constante dans tous les échantillons, il normalisera les biais d'extraction ou de contamination et les variations d'efficacité éventuelles de la transcription inverse. Il donnera ainsi en quelque sorte une image de la quantité de matrice apporté (ADNc).
Le DCt correspond à la différence entre le Ct du gène cible et celui du contrôle endogène.
C'est la normalisation par rapport au contrôle endogène.

Je ne suis pas un spécialiste du sujet mais j'espère que ça t'aura aider

Cordialement

[piwi]

J'ai fais un cours sur le principe de la qPCR, la méthode d'analyse que nous utilisons au labo et une méthode de choix des oligos.
Est ce que le powerpoint vous intéresse?

Je m'avance peut être un peu, je ne sais pas on peut mettre un powerpoint en ligne. Peut être en le passant au format pdf.

[LXR]

Moi ça 'intéresse, c'est toujours bien de savoir comment les autres labos s'y prennent avec une technique aussi controversée du point de vue de l'utilisation que chacun en fait : certains font systématiquement un gel d'agarose pour controler la taille du produit et la formation de dimères de primers, d'autres se servent carrément de l'ADNc du gène d'intérêt (labo à gros moyen de type HHMI) pour valider les primers,... En tout cas, pour des gènes qui sortent tard, j'ai toujours pas trouver de solution pour améliorer les courbes de fusion, malgré la validation des primers dans une lignée où ces mêmes gènes étaient bien exprimés. Je considère donc que mes résultats sont valides, malgré de bien piètres courbes de fusion dans la lignée où ils sont faiblement exprimés, mais des résultats correctement reproductibles.

Greg

[piwi]

Je pensais avoir le .ppt chez moi mais finalement je ne l'ai qu'au labo. Il faudra donc attendre lundi avant que je n'essaie de vous le mettre sur le forum au format .pdf

Cordialement,
piwi

[invite6a76d75a]

Salut

Il faut que je fasse une présentation sur la quantification relative de la PCR temps réel pour présenter mon projet de master. Je n'ai jamais fait cette expérience.
J'ai compris pourquoi il faut un gène de référence et je pense avoir compris ce que c'est le delta delta Ct mais je ne comprend pas la formule 2(exposant)ddCt
la valeur que nous donne l'ordinateur, c la ddCt, il faut l'appliquer à cette formule pour avoir la quantité d'ARN, on en fait koi ?
J'avoue que je suis perdue et tout ce kil ya sur internet n'est pas assez clair surtout que c'est en anglais.
Quelqu'un pourrait il me l'expliquer ???

[piwi]

Voici la cours que j'ai donné.

Cordialement,
piwi

[invited0ac54bb]

Salut,
Une question sur l'analyse des PCR quantitative "relative". Pour reprendre les termes lus sur un autre topic, c'est

estimer des variations d'un messager d'interet par rapport a un messager qui n'est pas cense varier au cours de l'experience

La formule que j'utilise dans mon fichier excel est 2^(variation du gene d'intérêt) / 2^(variation du gene référence).

Mon gène de référence est la tubuline. En général, je n'ai effectivement pas de variation de ce messager d'une condition à l'autre. Par contre, il m'arrive d'avoir des niveaux de tubuline différents d'une série de manip à l'autre, mais ce n'est pas grave tant que je compare des conditions qui partagent le même niveau de tubuline.

Ma question c'est: existe-t-il une méthode pour estimer des variations d'un messager... quand le messager référence se met à varier. Par exemple si je décide d'analyser des manips différentes où je n'ai pas eu le même taux de tubuline.

[LXR]

Du moment que le gène de référence ne varie pas entre les différentes conditions testées pour une manip donnée, il n'y a aucun inconvénient à comparer différentes manips entre elles. Ce que tu compareras sera les valeurs de ton gène d'intérêt normalisées par le gène de référence. Cette normalisation permet d'avoir un résultat comparable avec des manips faites antérieurement ou qui seront faites plus tard puisqu'elles affranchissent ta valeur d'intérêt de variations contaminantes.

Greg

[invited0ac54bb]

Soit ! Mais n'existe-t-il donc aucune méthode mathématique pour réajuster le taux de tubuline afin que je puisse comparer des conditions par rapport à un contrôle qui jusque là n'étaient pas comparables à cause de différence de niveau de tubuline "artéfactuelles" ?

J'y ai réfléchi depuis, et je me suis dit que si je faisais une gamme étalon de toutes les conditions contrôles que j'ai eu jusque là (je ferais un graphique : taux du messager d'intérêt par rapport au taux de tubuline de mes situations contrôles), je pourrais alors comparer toutes mes situations expérimentales par rapport à une situation contrôle extrapolée par ce graphique.

Mais bon... Ca ne marche pas. La courbe que j'obtiens n'a aucune forme mathématique particulière. Soit parce que je n'ai pas assez de valeurs (je vais essayer d'en collecter d'autres auprès de ma maître de stage), soit parce que j'ai inclus des valeurs d'expériences ratées, soit parce qu'il n'y a véritablement aucune relation mathématique qui lie la quantité de messager d'intérêt à ma tubuline dans les mêmes situations contrôles.

[kamor]

Bonjour, j'ai également un problème pour analyser des résultats en PCR temps réel Sybr Green.
Je viens de faire ma première PCR sur des échantillons avec une melt curve pour vérifier la spécificité de l'amplification. Mon problème est avec le seuil du melt peak car je n'arrive pas à comprendre ni à trouver sa signification dans l'analyse. J'ai des puits qui sont en dessous de ce seuil mais qui ont une courbe d'ampli normale, un seul pic au bon Tm. Que dois je en déduire?
Merci d'avance pour vos réponses

[LXR]

Bonjour,

Je ne comprends pas trop votre problème. Pourriez-vous joindre une image de votre courbe de fusion? D'après ce que je comprend, la valeur finale de fluorescence de vos puits ne dépasse pas la valeur seuil? Il n'y a donc pas de Ct? Votre qPCR est programmé pour combien de cycles? Car ce qui est surprenant c'est d'avoir une belle courbe de fusion tout en ayant un gène trop faiblement exprimé pour dépasser la valeur seuil. Habituellement dans ces cas là, la courbe de fusion est très évasée, très irrégulière, d'après mon expérience personnelle. Mon doute repose donc sur le nombre de cycle que vous avez programmé. Sur l'appareil que j'utilise, 40 cycles sont effectués. Toutefois pour des gènes sortant à 30-35 cycles, je me méfie d'autant plus que le Ct se rapproche de 35, au-delà de 35 cycles je considère que le gène n'est pas exprimé.

Greg

[piwi]

au-delà de 35 cycles je considère que le gène n'est pas exprimé.

Ca me semble drastique!
Au delà de 25 cycles on considère que la PCR est mois robuste (c'est à dire que l'on peut commencer à voir les effets de la dégradation de la TAQ, de son inhibition par les produits de la PCR etc...) C'est pourquoi il est important de faire au moins des triplicats de ses points pour pouvoir lisser les résultats avec un test statistique permettant leur interprétation. Passé 40 cycles il est plus difficile de quantifier à cause des différents évènements stochastiques qui se produisent dans la réaction. Cependant, on peut encore avoir une réponse dans certains cas (ex: expression ON/OFF, votre gène n'est pas du tout exprimé dans une condition et l'est toujours dans une autre.)
Je pense que ne plus tenir compte de ces gènes est dommage parce que c'est certainement une perte d'informations. Il faut simplement adapter son analyse.

Cordialement,
piwi

[kamor]

Merci pour votre réponse.
En fait ma PCR est programmé sur 35 cycles, mes puits positifs ont un CT de 14-17 donc de ce côté il n'y a pas de problèmes.
Mon problème c'est vraiment l'interprétation d'un pic de fusion situé en dessous du seuil. Je crois comprendre qu'on peut relier la surface du pic à la quantité d'amplicons formés. Si c'est bien le cas, le fait que le pic ne dépasse pas le seuil est il un facteur éliminatoire?
Merci en tout cas pour vos réponses.

[kamor]

Désolé je viens de remarquer que mon png n'est pas passé, je rééssaye

[LXR]

Les courbes situées tout en bas du graphique ressemblent fortement à ce que l'on obtient dans les puits "blancs" (mix de qPCR sans ADNc). Dans ce cas là, cela est tout à fait normal et valide par la même occasion vos conditions de PCR.

Ce que tu dis Piwi m'intéresse fortement! Si tu penses qu'il est dommage de se délester de gènes sortant au-delà de 35 cycles, cela veut certainement dire que tu as obtenu des courbes de fusion validant des quantifications sur de tels gènes. Donc des courbes de fusion où l'on voit se dessiner un pic. Dans mon cas, pour ce type d'expression, il n'y a pas un seul gène qui ait une courbe de fusion correcte, cela ressemble à du bruit de fond. Cela m'embête énormément car ces gènes sont super bien modulés dans les conditions voulues par rapport au contrôle, ils sont assez nombreux, et les modulations sont reproductibles...Utilises-tu du syBRGreen ou une sonde Taqman? Appliques-tu un mode opératoire particulier quand tu es confronté à ce genre de situation (surtout pour la validation, pour s'assurer que ce n'est pas du non spécifique)?

Merci d'avance

Greg