PCR quantitative

[invite02cefc91]

Bonjour,

J'aurais quelques questions pour des spécialistes de la PCR quantitative.

Voilà je vais bientôt m'y mettre, et j'aurais besoin de quelques précisions, j'ai compris le principe sans pb, avec le Ct et compagnie.
Mais voilà j'ai quelques questions qui sont liés d'ailleurs :

- Donc en PCRq, on compare notre gène d'intérêt avec un "housekeeping" gene, ma question est la suivante notre résultat il sort sous quelle forme, en nombre de copies par cycle ? ou es-ce qu'on peut ramener ça en quantité, ng par exemple.
Car moi ce qui m'intéresserait si c'est possible c'est de savoir au final dans mon échantillon, quel est la quantité en ng de mon gène d'intérêt. Es ce que cela est possible ? et si oui comment on peut le faire ?


Merci d'avance pour les éventuels lecteur qui pourront m'aider ou pas
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[invitee863e61a]

En principe, tu devrais connaître le nombre initial de copies de ta molécule d'intérêt (en fait, du fragment d'intérêt) dans ton échantillon. Tu peux alors en déduire ta quantité de cette molécule en ng.
Mais si tu ne fais de la quantification relative, tu ne sauras que le nombre de copies de ton gène par rapport au gène de ménage.

[invite8c0cc995]

Théoriquement en utilisant une gamme standard avec des quantités connues d'ADN tu peux tout à fait exprimer tes résultats en ng d'ADN dans ton échantillon, ce que l'on appelle de la quantification absolule
MAIS :

1. Il faut que l'appareil utilisé pour quantifier l'ADN ayant servis à faire la gamme étalon soit extrémement précis, sinon tu feras de la quantification absolue, par rapport à une référence fausse. Donc la précision de ta quantif en qPCR dépendra de la précision de ton étalon. Comment faire un bon étalon alors ? Si c'est par dosage qPCR, c'est le chat qui se mort la queue, si c'est pas dosage spectro, cela signifie que ton standard correspond à ta séquence cible pure (fragments de PCR, vecteur contenant la séquence d'intérêt, etc...)

2. D'où 2ème problème : il peut arriver que l'efficacité de la PCR soit différente entre la PCR sur la gamme standard et la PCR sur l'échantillon. Notamment si les conditions/méthodes d'extraction d'ADN sont différentes, tu peux avoir des contaminants différents qui vont influer différement sur l'efficacité de PCR, et donc l'utilisation de la gamme standard sera un peu faussée. Ca fait partie des limitations de la technique qu'il est bon de garder dans un coin de sa tête.
Une solution ? Utiliser ton échantillon pour faire une gamme standard pour vérifier l'efficacité d'amplification, mais dans ce cas tu n'auras bien évidement pas de quantification absolue, tu ne pourras faire que du relatif par rapport à un gène de ménage, sans compter l'augmentation des coûts due au fait que théoriquement il faudrait faire une gamme pour chaque échantillon...

DONC : tout dépend de la précision requise, du type de matrice (ADNc, ADN génomique, ...), de l'origine des échantillons (végétal, animal, bactérien) et de la qualité d'extraction des acides nucléiques.

[invite4ff9937a]

Je ne crois pas quand PCR quantitative on compare son géne d'intéret à un "housekeeping gene". Sa c'est la PCR semi quantitative.

La Q PCR c'est établir une gamme étalon d'un ADN controle ( Quantité d'ADN au départ connu) généralement un plasmide avec 1000, 10 000 100 000 et enfin 1 000 000 copies et définir pour chaque quantitées le nombre de cycle néssaires pour avoir un signal différent du bruit de fond (le cT) celui-ci est donc inversement proportionnelle à la quantitée d'ADN du départ. Plus il y à d'ADN au départ dans l'échanillon plus le cT arrive vite. On peux alors définir la quantitée d'ADN dans un échantillon X en le placant sur la droite! C'est la seul utilitée de la Q PCR: détérminer le nombre de copie ou quantité d'ADN dans l'échantillon du DEPART!

Je ne comprend donc pas pourquoi tu veux connaitre ta quantitée final dans ton échantillon?
Je ne comprend pas pourquoi jmbowi dit que l'on devrai connaitre la quantité d'ADN du départ, car pour moi il n'y a alors aucune necéssité faire une Q PCR!

Si j'ai mal saisi vos propos pardon d'avance!

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8c0cc995]

Excuses acceptées.
en fait Malesore parlait implicitement de PCR quantitative en temps réel. L'énorme majortiré des personnes utilisant la Real Time QPCR le fond en utilisant un gène de référence. Cela reste tout a fait quantitatif, vu que chaque gène est quantifié de manière indépendante. Chez Roche dans les options d'analyse il y a "Relative Quantification" ou "Absolute Quantification".
Et comme dit dans tous les cas il faut une référence.
On peut disserter pendant des heures sur l'utilisation d'une référence absolue ou relative. Dans tous les cas aucune n'est parfaite.
Ton plasmide, comment est tu sur qu'il est à 1000 copies et pas 1500 ou 2000 copies. Dans ce cas tu es relatif à ton nombre de copies qui n'est pas si absolue que ca...

[invite4ff9937a]

Oki

merci pour la précision

[invite02cefc91]

Merci pour vos remarques, et connaissances, je vais me plancher sur tout ça. c'est pas gagné .....


merci