cDNA microarray et RNA seq

[invite24a6b4c6]

Bonjour,
J'ai quelques soucis pour comprendre ces deux techniques et leur interêt. Je m'explique:
Le cDNA microarray consiste en:
1- recupérer l'ARNm de notre cellule d'intéret
2- le rétrotranscrire et marquer cet ADNc rétrotranscrit par une colorant fluorescent
3- hybrider sur puce
4- analyser et comparer à un témoin
--> In fine, on obtient une analyse du transcriptome : on voit quels gènes sont transcrits
Le RNA seq consiste en :
1- extraire les ARN totaux de la cellule
2- fragmenter cet ARN
3- le rétrotranscrire
4- Séquençage PCR
5- production de read
--> In fine, si on fait en sorte de ne sélectionner que les ARNm, on aboutit à la même conclusion que si on avait fait le cDNA microarray, non?

Est-ce que ma méthodologie de RNA seq est bonne ou est-ce qu'il me manque des étapes?

Merci d'avance!!
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[Flyingbike]

Il y a une différence qui fait toute la différence

En microarray on a des sondes prédéfinies, on se limite donc à détecter ce que détectent les sondes

En RNAseq, on séquence donc on est quasiment exhaustif. Et comme on couvre beaucoup plus, on a bien plus d'informations (introns, splice variants, etc...)

[invite24a6b4c6]

Ah ok, merci!!!

[invite24a6b4c6]

Super, merci beaucoup pour ta réponse!!
Est-ce que mes étapes pour le RNA seq sont bonnes?

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

je n'ai jamais fait de RNAseq, mais sur le principe ca m'a l'air correct

A part qu'il manque le plus important et le plus compliqué : alignement et analyse !

[invite24a6b4c6]

Merci!!!

[invite9c236b9b]

Bonjour, après avoir regardé http://biochimej.univ-angers.fr/Page.../1PucesADN.htm j'ai l'impression que le microarray/puce à ADN est l'alliance de 3 concepts

- En collant sur une puce en des endroits distincts N bouts d'ADN différents et en passant dessus de l'ADN marqué (fluorescent) on peut détecter d'un coup tous les appariements de chaines complémentaires. L'ADN marqué ça veut dire qu'on a extrait l'ADN de notre échantillon (un bout de plan de riz) et qu'on l'a retranscrit en ajoutant dans la synthèse des nucléotides modifiés qui s'intègrent dans les chaines.

- Il existe une technique industrielle pour coller (ou plutôt synthétiser in-situ) sur la puce 1 million de séquences de 25 nucléotides choisies comme on veut

- Une fois qu'on a séquencé tout le matériel génétique de plusieurs plans de riz (et des bactéries environnantes) on peut faire un algorithme qui va choisir ce million de séquences de telle manière à ce que la puce détecte d'un coup la présence de chaque gène, allèle, les maladies présentes, etc (c'est un autre algorithme qui décode le résultat donné par la puce ADN, et c'est peut-être le plus compliqué car c'est difficile de prévoir ce qu'on veut chercher)

L'ensemble a l'air super utile si on travaille sur le riz génétiquement modifié et les produits phytosanitaires.

Est-ce que c'est à peu près ça ?

[Flyingbike]

Oui c'est à peu près ça.

Notons que les approches par puces vont probablement tendre à diminuer au profit des séquençages complets, de la métagénomique et autres approches plus exhaustives